江蘇宜興地區(qū)丙型肝炎病毒基因型分布和包膜區(qū)變異研究.pdf

1、本課題以江蘇省宜興市為研究現(xiàn)場，從病原學(xué)角度開展了以人群為基礎(chǔ)的丙型肝炎分子流行病學(xué)研究。 第一部分：江蘇宜興地區(qū)丙型肝炎病毒 基因型分布研究 HCV基因組的核苷酸序列具有高度的變異性，目前主要分為六個基因型，即1～6型。不同基因型存在明顯的地區(qū)分布差異，而且HCV的基因型對判斷丙型肝炎治療的難易程度及其預(yù)后具有重要的意義，故了解本地區(qū)HCV基因型分布特征作為進(jìn)一步深入研究丙型肝炎慢性化的基礎(chǔ)資料有其必要性。本研

2、究采用Simmonds基因分型方法，依據(jù)HCV的保守區(qū)段5'非編碼區(qū)(5'NCR)設(shè)計1、2、3和1b型特異性引物，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法擴(kuò)增分型，并對不同基因型在人群中的分布作統(tǒng)計描述。主要結(jié)果如下：1.HCVRNA陽性檢測和基因分型研究 檢測158份抗HCV陽性血清，其中95份HCVRNA陽性，陽性率為60.1﹪，基因分型結(jié)果1b型80例(84.2﹪)，2a型5例(5.3﹪)，1b/2a型混合感染5例(5.

3、3﹪)，分型不明確者5例(5.3﹪)。2.HCV基因型在不同性別人群中的分布研究 男性丙型肝炎患者中HCV基因型以1b為主，占88.2﹪，其余為2型以及1b與2型的混合感染，分別占7.9﹪和1.5﹪；女性丙型肝炎患者中1b型占74.0﹪，未檢測到2型，而1b和2型的混合感染發(fā)現(xiàn)4例，占14.8﹪。 3.HCV基因型在急、慢性丙型肝炎和肝硬化患者中的分布研究 在HCVRNA陽性的患者中，急性丙型肝炎的HCV基因型均

4、為1b型，慢性輕度丙型肝炎患者(ALT≤200U/L)中1b和1b/2a型共占89.8﹪，慢性重度丙型肝炎患者(ALT＞200U/L)中為88.4﹪，肝硬化患者中為84.6﹪。 4.HCV基因型在有輸血史及無明確輸血史患者中的分布研究 有明確輸血史的丙型肝炎患者組與無明確輸血史患者組，基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.414)。 5對分型產(chǎn)物的測序驗證工作 本研究基因分型結(jié)果為1b型的樣本測得5'NCR

5、區(qū)擴(kuò)增片段序列與GENBANK上HC-J4株相應(yīng)序列同源性為99.2﹪；分型結(jié)果為2型的樣本測得與GENBANK上HC-J6株相應(yīng)序列同源性為97.7﹪。 第二部分：丙型肝炎病毒準(zhǔn)種復(fù)雜性與臨床關(guān)系的研究 準(zhǔn)種變異在丙型肝炎的慢性化中起到的作用需要深入研究和探討。本研究采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法，對44例未經(jīng)干擾素治療的慢性丙型肝炎和肝硬化患者的HCV進(jìn)行準(zhǔn)種檢測。分析準(zhǔn)種復(fù)雜性與臨床肝損害指標(biāo)之間的關(guān)系，主要結(jié)

6、果如下： 1.不同臨床情況的丙型肝炎患者準(zhǔn)種復(fù)雜性比較 ALT(≤45U/L)正常的患者組準(zhǔn)種條帶數(shù)為2.54±1.05，ALT異常(＞45U/L)組，準(zhǔn)種條帶數(shù)為4.48±2.14，兩組的準(zhǔn)種條帶數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，說明準(zhǔn)種在ALT異常的患者中復(fù)雜性較高。 2.影響肝損害程度的多因素Logistic回歸分析 將ALT按照正常與否作為二分類結(jié)局變量，年齡、性別、基因型、肝硬化程度、準(zhǔn)

7、種復(fù)雜與否納入Logistic回歸模型，分析結(jié)果顯示，準(zhǔn)種的復(fù)雜與否對ALT有顯著影響，OR值為12.884，可信區(qū)間為2.390～69.463，說明準(zhǔn)種的復(fù)雜性是肝臟損害程度的獨立影響因素。 第三部分：1b型丙型肝炎病毒包膜區(qū)變異進(jìn)化研究 本研究從1b型HCV包膜區(qū)的核苷酸序列和高變區(qū)的氨基酸序列變異入手，采用生物信息學(xué)方法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，研究HCV的生物學(xué)特點。主要結(jié)果如下： 1.HCVE2區(qū)的核苷酸序列和HR

8、-1的氨基酸序列變異研究 測序獲得的10株HCVE2區(qū)序列經(jīng)分析比對后，發(fā)現(xiàn)不同患者來源的E2區(qū)核苷酸差異較大，變異度最大的區(qū)域集中在HR-1(1491-1573nt)，但從序列的比對結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)很多位點具有保守性，保守堿基占64.8﹪(204/315)；而HR-1的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，不同患者來源的HCV株在此區(qū)域多個固定的氨基酸位點同樣具有很好的保守性，保守的氨基酸位點占22.2﹪(6/27)。 2.系統(tǒng)進(jìn)化樹分析