CUL4A促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，已位居?jì)D女惡性腫瘤死因的首位。我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率雖相對(duì)于西方歐美國(guó)家較低，但近年來(lái)隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，全國(guó)平均乳腺癌死亡率已達(dá)2.61/10萬(wàn)人次?，F(xiàn)階段乳腺癌治療主要采取手術(shù)為主的綜合治療，包括放療、化療和內(nèi)分泌治療等。經(jīng)大量隨訪發(fā)現(xiàn)，Ⅱ-Ⅲ期患者雖然經(jīng)手術(shù)治療或放化療，5年內(nèi)仍有60-70％患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因之一。近期研究表

2、明，乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因，EMT是指具有極性的細(xì)胞獲得自由移動(dòng)于細(xì)胞基質(zhì)間的能力的過(guò)程，以上皮表型缺失和間質(zhì)表型獲得為主要特征。乳腺癌細(xì)胞通過(guò)EMT獲得更強(qiáng)的移動(dòng)和侵襲能力，穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)及血管基底膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而形成遠(yuǎn)處繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶，是乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。因此，尋找參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT的分子標(biāo)記物能夠作為乳腺癌預(yù)后的指

3、標(biāo)，而且以此為靶點(diǎn)，在深入研究其調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制基礎(chǔ)上，研發(fā)相應(yīng)的個(gè)性化治療手段，是當(dāng)前乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　泛素是由76個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑受到嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控。在ATP的作用下，泛素被泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)激活后轉(zhuǎn)移至泛素偶聯(lián)酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)，再由泛素連接酶(ubiquitin

4、ligase，E3)將泛素轉(zhuǎn)移到特定的底物上，最后被泛素修飾的底物進(jìn)入蛋白酶體(proteasome)進(jìn)行降解。E3泛素連接酶在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，決定著反應(yīng)的特異性。CUL4A是發(fā)現(xiàn)較晚的一類泛素連接酶，與DDB1蛋白及Roc1相互作用構(gòu)成E3復(fù)合體(CUL4A-DDB1-Roc1)。CUL4A在腫瘤中的研究始于乳腺癌，在原發(fā)性乳腺癌中大量擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)。隨后的研究表明，在鱗狀細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肝癌和惡性

5、胸膜間皮瘤中也存在著CUL4A擴(kuò)增。最近，全基因組SNP數(shù)組分析揭示了在部分肺癌和卵巢癌以及其它實(shí)體瘤中也同樣存在CUL4A基因擴(kuò)增。而且，CUL4A高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，其表達(dá)水平與總生存率和無(wú)病生存率有密切相關(guān)性，這表明CUL4A的異常調(diào)節(jié)可能促進(jìn)腫瘤形成。然而，CUL4A是否能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移尚未見(jiàn)研究報(bào)道。
　　本研究主要集中于CUL4A調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT以及侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并深入研究其可能的分子機(jī)

6、制，本研究的成功實(shí)施不僅豐富了CUL4A在乳腺癌中的生物學(xué)功能，而且還為探討新的乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療方法提供了新的研究靶點(diǎn)。
　　第一部分E3泛素連接酶CUL4A與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究
　　[目的]
　　應(yīng)用常見(jiàn)細(xì)胞株和組織芯片研究在惡性程度不同的細(xì)胞中以及不同腫瘤類型中CUL4A的表達(dá)，并分析CUL4A與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為進(jìn)一步明確CUL4A在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　[方法]
　　1.應(yīng)用本

7、實(shí)驗(yàn)室保藏的常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞株，通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞株中CUL4A的表達(dá)情況。
　　2.應(yīng)用Biomax生物公司的乳腺癌組織芯片(BR954)，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CUL4A在正常乳腺組織、原位癌組織和具有轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌組織中的表達(dá)情況。
　　3.應(yīng)用Biomax生物公司的胃癌組織芯片(ST8041)，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CUL4A在正常胃組織、原位癌和具有轉(zhuǎn)移特性的胃癌組織中的表達(dá)情況

8、。
　　4.應(yīng)用Biomax生物公司的卵巢組織芯片(OV2089)，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CUL4A在正常卵巢組織、原位癌和具有轉(zhuǎn)移特性的卵巢癌組織中的表達(dá)情況。
　　5.應(yīng)用Biomax生物公司的結(jié)腸癌組織芯片(C020814)，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CUL4A在正常結(jié)腸組織、原位癌和具有轉(zhuǎn)移特性的結(jié)腸癌中的表達(dá)情況。
　　[結(jié)果]
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示CUL4AmRNA表達(dá)水平在正常乳腺癌上皮細(xì)胞中

9、(MCF10A)表達(dá)最低，在非侵襲性乳腺癌上皮細(xì)胞中(MDA-MB-468、MCF7、HCC1569)表達(dá)較高，而在侵襲性乳腺癌細(xì)胞中(MDA-MB-231、BT549)表達(dá)水平最高。
　　2.Western blot結(jié)果顯示在各型細(xì)胞株中CUL4A的蛋白表達(dá)水平與其mRNA表達(dá)水平相一致，即在正常乳腺癌上皮細(xì)胞中(MCF10A)表達(dá)最低，在非侵襲性乳腺癌上皮細(xì)胞中(MDA-MB-468、MCF7、HCC1569)表達(dá)較高，而在侵

10、襲性乳腺癌細(xì)胞中(MDA-MB-231、BT549)表達(dá)最高。
　　3.通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達(dá)結(jié)果表明正常乳腺中CUL4A表達(dá)較低，原位癌中表達(dá)較高，而具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌中CUL4A的表達(dá)最顯著。
　　4.通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達(dá)結(jié)果表明正常胃組織中CUL4A表達(dá)較低，原位癌中表達(dá)較高，而具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌中CUL4A的表達(dá)最顯著。
　　5.通過(guò)免疫

11、組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達(dá)結(jié)果表明正常卵巢組織中CUL4A表達(dá)較低，原位癌中表達(dá)較高，而具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的卵巢癌中CUL4A的表達(dá)最顯著。
　　6.通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸癌組織芯片中CUL4A的蛋白表達(dá)結(jié)果表明正常結(jié)腸組織中CUL4A表達(dá)較低，原位癌中表達(dá)較高，而具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中CUL4A的表達(dá)最顯著。
　　[結(jié)論]
　　1.CUL4A在各型乳腺細(xì)胞株中表達(dá)不同，侵襲性強(qiáng)的細(xì)胞株中表達(dá)高，

12、侵襲性低的表達(dá)較低，表明CUL4A表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。
　　2.不同類型腫瘤的組織芯片免疫組化結(jié)果證明，具有轉(zhuǎn)移特性的腫瘤組織中CUL4A表達(dá)增加顯著，而原位癌CUL4A表達(dá)相對(duì)較低，表明CUL4A與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性。
　　第二部分CUL4A促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究
　　[目的]
　　第一部分研究結(jié)果提示CUL4A可能具有促進(jìn)乳腺癌遷移、轉(zhuǎn)移的能力。為此，本部分

13、通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CUL4A是否具有誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用。
　　[方法]
　　1.通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染pBabe-CUL4A及其空白對(duì)照質(zhì)粒，在CUL4A低表達(dá)的MDA-MB-468和MCF7細(xì)胞系中構(gòu)建CUL4A過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株及其對(duì)照(MDA-MB-468-pBabe、MDA-MB-468-pBabe-CUL4A、MCF7-pBabe、MCF7-pBabe-CUL4A)。嘌呤霉素篩

14、選后應(yīng)用qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證CUL4A表達(dá)改變。
　　2.通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染pSuper-shCUL4A及其空白對(duì)照質(zhì)粒，在CUL4A表達(dá)較高的MDA-MB-231和BT549細(xì)胞系中構(gòu)建CUL4A低表達(dá)的細(xì)胞株及其對(duì)照(MDA-MB-231-pSuper、MDA-MB-231-pSuper-shCUL4A、BT549-pSuper、BT549-pSuper-shCUL4A)。嘌呤霉素篩選后應(yīng)用qRT-PC

15、R和Westem blot驗(yàn)證CUL4A表達(dá)改變。
　　3.分別應(yīng)用上述構(gòu)建成功的CUL4A穩(wěn)定沉默或上調(diào)的細(xì)胞株，通過(guò)光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以及應(yīng)用qRT-PCR、Western blot、激光共聚焦結(jié)合免疫熒光染色等技術(shù)檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)記分子(E-cadherin、α-catenin、N-cadherin、Vimentin等)的表達(dá)，觀察CUL4A調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT的作用。
　　4.應(yīng)用上述構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)

16、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CUL4A調(diào)控乳腺癌細(xì)胞遷移能力的作用;通過(guò)Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CUL4A調(diào)控乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的作用。
　　5.應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)CUL4A的乳腺癌細(xì)胞株及其空白對(duì)照建立裸鼠異種移植瘤模型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，研究上調(diào)CUL4A表達(dá)是否能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　6.應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A抑制序列的乳腺癌細(xì)胞株及其空白對(duì)照構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型和

17、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，研究下調(diào)CUL4A表達(dá)是否能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　7.通過(guò)qRT-PCR、Western blot以及免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)各組瘤體和轉(zhuǎn)移灶中CUL4A、E-cadherin、和Vimentin等表達(dá)的改變，進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的EMT改變。
　　[結(jié)果]
　　1.成功構(gòu)建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A的乳腺癌細(xì)胞株及其空白對(duì)照(MDA-MB-468-pBabe、MDA-MB

18、-468-pBabe-CUL4A、MCF7-pBabe、MCF7-pBabe-CUL4A)。
　　2.成功構(gòu)建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A干擾序列的的乳腺癌細(xì)胞株及其空白對(duì)照(MDA-MB-231-pSuper、MDA-MB-231-pSuper-shCUL4A、BT549-pSuper、BT549-pSuper-shCUL4A)
　　3.CUL4A促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin、Vimentin的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志分

19、子E-cadherin、α-catenin的表達(dá)。
　　4.CUL4A能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞形態(tài)從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　5.CUL4A促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。
　　6.體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)表明，CUL4A具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　[結(jié)論]
　　1.CUL4A具有調(diào)控乳腺癌上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的作用。
　　2.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明CUL4A能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

20、r>　　第三部分CUL4A促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移作用的分子機(jī)制研究
　　[目的]
　　臨床標(biāo)本檢測(cè)以及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明CUL4A具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的能力，但其具體的作用機(jī)制尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，本部分主要目的旨在通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)明確其可能的分子機(jī)制。
　　[方法]
　　1.Affymetrix（昂飛）Gene Chip Human U133 Plus 2.0 cartridge基因芯片檢測(cè)過(guò)表達(dá)

21、CUL4A對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468基因表達(dá)譜的影響，篩選可能的調(diào)控機(jī)制。
　　2.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞系中，應(yīng)用qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證基因芯片結(jié)果中與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)。
　　3.Western blot檢測(cè)組蛋白H3甲基化改變情況。
　　4.染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合qPCR技術(shù)檢測(cè)CUL4A對(duì)H3K4me3結(jié)合ZEB1啟動(dòng)子能力的影響。
　　5.在MDA-MB-4

22、68-pBabe-CUL4A細(xì)胞中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)ZEB1表達(dá)的細(xì)胞株及其對(duì)照。
　　6.Western blot檢測(cè)上述細(xì)胞中EMT標(biāo)記分子的改變。
　　7.應(yīng)用上述構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;通過(guò)Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。
　　8.應(yīng)用上述構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察腫瘤

23、轉(zhuǎn)移情況，研究下調(diào)ZEB1表達(dá)是否能夠阻斷CUL4A介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　9.應(yīng)用Biomax生物公司的乳腺癌組織芯片(BR954)，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ZEB1在正常乳腺組織、原位癌和轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)情況，并分析ZEB1的表達(dá)與CUL4A表達(dá)的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]
　　1.基因芯片結(jié)果表明CUL4A表達(dá)增加能夠顯著促進(jìn)EMT關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子ZEB1的表達(dá)，qRT-PCR以及Western blot結(jié)果同樣也證

24、明在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CUL4A的細(xì)胞中CUL4A能夠調(diào)節(jié)ZEB1的表達(dá)。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的組蛋白H3甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)表明，CUL4A能夠促進(jìn)H3K4的三重甲基化(H3K4me3)。
　　3.染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明，CUL4A能夠促進(jìn)H3K4me3與ZEB1基因啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　4.干擾ZEB1表達(dá)后能夠抑制CUL4A高表達(dá)導(dǎo)致的EMT改變。
　　5.干擾ZEB1表達(dá)后能夠抑制CUL4A導(dǎo)致的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力

25、的改變。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明干擾ZEB1表達(dá)后能夠抑制CUL4A導(dǎo)致的乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　7.組織芯片檢測(cè)ZEB1表達(dá)顯示，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，ZEB1表達(dá)最高，而在正?；蛟话┲衂EB1表達(dá)較低。
　　8.相關(guān)性分析提示，乳腺癌組織中CUL4A表達(dá)與ZEB1的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)性。
　　[結(jié)論]
　　1.CUL4A通過(guò)促進(jìn)H3K4的三重甲基化(H3K4me3)，而H3K4me3結(jié)合于