生殖支原體MgPa重組蛋白的表達、純化及免疫活性研究.pdf

1、目的:構建生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)黏附蛋白MgPa的優(yōu)勢表位(1075~1364aa)基因(MgPa')的重組表達體,在大腸桿菌中進行誘導表達,純化表達產物并進行免疫原性和免疫反應性分析,為探索MgPa重組蛋白在Mg血清學診斷中的應用價值和其生物學功能提供實驗依據。
　　方法:通過生物信息學分析,篩選并挑選MgPa基因優(yōu)勢抗原表位,以Mg G-37標準株基因組DNA為模板,高保真聚合酶鏈反應擴

2、增目的片段,將其亞克隆到原核表達載體pET-30a(+)中,構建重組質粒pET-30a(+)/MgPa',然后轉化至表達宿主菌E.coliRosettaTM2(DE3)中進行誘導表達,利用SDS-PAGE和Western-Blot進行分析和鑒定表達產物;用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,BCA法測定純化蛋白濃度。用純化的MgPa重組蛋白(rMgPa')免疫新西蘭兔,間接ELISA方法檢測免疫兔血清中MgPa'多克隆抗體的效價,對rM

3、gPa'的免疫原性進行分析。同時用純化的rMgPa'包被微孔板,建立間接ELISA方法,檢測Mg感染者陽性血清及對照血清,根據重組蛋白與Mg陰、陽性血清的反應情況,對rMgPa'的免疫反應性作出評價。
　　結果:Expasy軟件分析MgPa基因的抗原表位選擇了MgPa'基因的3223~4092bp位堿基序列為目的基因(MgPa',片段長度為870bp,編碼290個aa);PCR擴增得到大小約為870bp的目的片段;構建的重組質粒經

4、酶切鑒定和測序鑒定證明其中插入片段為MgPa'目的基因,測序結果與Genbank上登錄序列完全一致;SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導下,重組工程菌表達了一相對分子量(Mr)約為37 KDa的目的蛋白條帶,目的蛋白在菌體細胞內主要以可溶性蛋白形式存在;經Ni-NTA親和純化獲得了較高純度的重組蛋白;利用純化的rMgPa'免疫新西蘭兔,間接 ELISA法測定兔免疫血清特異性抗體效價在1﹕1280以上;Western-blot檢測rM

5、gPa'能與Mg免疫新西蘭兔抗血清發(fā)生特異性反應;以純化的rMgPa'為包被抗原建立間接ELISA法,對Mg感染者的陽性血清及對照血清進行檢測,結果顯示重組蛋白能和Mg感染者陽性血清特異性反應,表明重組蛋白有良好的免疫反應性。
　　結論:
　　1、成功構建了pET-30a(+)/MgPa'原核表達體,將其轉化至大腸桿菌后表達出了一相對分子量(Mr)約37KDa的重組蛋白;
　　2、rMgPa'具有較好的免疫原性,能刺激