缺氧預(yù)處理對大鼠神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討不同時(shí)間缺氧處理對體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的影響；缺氧預(yù)處理對大鼠神經(jīng)干細(xì)胞再次經(jīng)受致死性缺氧的內(nèi)源性保護(hù)作用以及促紅細(xì)胞生成素(EPO)在保護(hù)機(jī)制中的作用。 方法：取孕13天的SD胎鼠腦組織，懸浮法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，免疫組織化學(xué)方法鑒定細(xì)胞性質(zhì)及分化潛能情況。施加1～12小時(shí)不同時(shí)間缺氧培養(yǎng)，觀察其對NSCs生長、分化的影響，以 MTT 法測定缺氧對細(xì)胞活性的影響，并以western blot法檢測缺氧4小時(shí)

2、后 EPO 蛋白的表達(dá)。以4小時(shí)為缺氧預(yù)處理?xiàng)l件，12小時(shí)為致死劑量缺氧處理?xiàng)l件，分別在缺氧預(yù)處理4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h，再次給予致死劑量缺氧處理，檢測細(xì)胞存活率以觀察預(yù)處理對NSCs的保護(hù)作用，以同時(shí)加入EPO中和抗體、非特異性IgG以及未經(jīng)預(yù)處理的神經(jīng)干細(xì)胞作對照組。根據(jù)預(yù)處理與致死劑量缺氧的時(shí)間間隔分為兩組：4小時(shí)組、24小時(shí)組，測定細(xì)胞致死缺氧后即刻、4小時(shí)的 EPO 表達(dá)情況。 結(jié)果：懸浮

3、法培養(yǎng)所獲細(xì)胞的 nestin 鑒定為陽性，同時(shí)具有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多分化潛能。缺氧時(shí)間不超過4小時(shí)，對NSCs大體形態(tài)、進(jìn)一步培養(yǎng)、分化無明顯影響，缺氧后細(xì)胞存活率無顯著變化；缺氧時(shí)間為8、12小時(shí)，可顯著降低培養(yǎng)后的細(xì)胞活性。經(jīng)過缺氧預(yù)處理的NSCs，在處理后12～48小時(shí)間，對再次經(jīng)歷的致死性缺氧有明顯耐受作用，與對照組相比較，其細(xì)胞存活率顯著提高。這種保護(hù)作用可以被EPO中和抗體所阻斷，而非特異性IgG無效。

4、缺氧預(yù)處理后的EPO蛋白即刻表達(dá)，4小時(shí)達(dá)到頂峰，可維持至8小時(shí)。預(yù)處理與致死缺氧間隔為4、24小時(shí)的兩組細(xì)胞再次缺氧后即刻的EPO蛋白表達(dá)無顯著差異，4小時(shí)后，24小時(shí)組細(xì)胞的EPO表達(dá)量明顯高于4小時(shí)組。 結(jié)論：4小時(shí)的缺氧處理對體外培養(yǎng)的大鼠NSCs較為安全，其形態(tài)、增殖、分化以及細(xì)胞存活率無特殊變化，可以作為預(yù)處理?xiàng)l件；缺氧預(yù)處理可以使NSCs對一定時(shí)間內(nèi)的再次致死缺氧具有耐受保護(hù)作用；這種保護(hù)作用可能與缺氧后NSCs