蘋(píng)果cystatin家族基因在非生物逆境脅迫應(yīng)答中的功能研究.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)是生物體內(nèi)能夠抑制半胱氨酸蛋白水解酶活性的一類(lèi)蛋白。盡管cystatin基因已經(jīng)在許多植物（包括擬南芥、水稻、大麥、大豆、馬鈴薯、小麥等）中得到了分離和鑒定，但關(guān)于蘋(píng)果cystatin家族基因的生物學(xué)功能方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用已公布的蘋(píng)果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，系統(tǒng)鑒定了蘋(píng)果基因組中所有的cystatin基因，并進(jìn)一步對(duì)它們進(jìn)行了分類(lèi)、染色體定位、內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化、啟動(dòng)子元件分析以及

2、在蘋(píng)果不同組織的表達(dá)模式分析，同時(shí)檢測(cè)了cystatin基因在干旱、低溫、高溫、脫落酸(ABA)、氧化脅迫等不同的非生物脅迫下的表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上對(duì)蘋(píng)果屬植物‘富平楸子’(Malus prunifolia)MpCYS2、MpCYS4和MpCYS5基因的抗逆生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。所獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.在蘋(píng)果基因組中鑒定到26個(gè)cystatin家族基因成員，分布在蘋(píng)果的9條染色體上，這些基因編碼的蛋白質(zhì)含有cystatin

3、保守的特征結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明植物中的cystatin基因可以分為4個(gè)亞族，而蘋(píng)果cystatin基因主要聚類(lèi)到其中的3個(gè)亞族。對(duì)cystatin基因在不同組織的表達(dá)模式分析表明，選取的8個(gè)cystatin基因在楸子的根、莖、葉、花和種子中表現(xiàn)出組成型表達(dá)。在葉片的成熟、衰老過(guò)程以及不同非生物脅迫處理后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該家族基因可能參與蘋(píng)果屬植物生長(zhǎng)發(fā)育、葉片衰老以及抵御非生物脅迫過(guò)程。隨后，從楸子成熟葉片中克隆得到5

4、個(gè)cystatin基因(MpCYS1、MpCYS2、MpCYS3、MpCYS4、MpCYS5)，它們均含有高度保守的cystatin結(jié)構(gòu)域。
　　2.MpCYS2基因的表達(dá)受到干旱、MV及外源ABA的誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位分析表明，MpCYS2基因主要定位于洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。擬南芥異源表達(dá)MpCYS2可以促進(jìn)滲透脅迫及氧化脅迫下種子的萌發(fā)和籽苗的生長(zhǎng)。同時(shí)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株抗性更強(qiáng)，表現(xiàn)為葉片電導(dǎo)率更低、葉綠素含

5、量更高、丙二醛積累量更低。脫水處理下，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)活性氧(ROS)的積累量較少。另外，MpCYS2基因過(guò)量表達(dá)也影響了滲透脅迫下根毛的發(fā)育。這些研究結(jié)果表明，MpCYS2影響干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)和耐旱性可能是通過(guò)影響植株體內(nèi)ROS的積累和根毛的發(fā)育來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　3.MpCYS4基因的表達(dá)受到干旱、高溫、MV及外源ABA的誘導(dǎo)，在葉片衰老過(guò)程中該基因的表達(dá)量也明顯提高。亞細(xì)胞定位分析表明，MpCYS4主要定位于洋蔥表皮細(xì)胞

6、的細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。并且，MpCYS4體外純化的融合蛋白對(duì)木瓜蛋白酶的活性具有抑制效果。MpCYS4基因在擬南芥和蘋(píng)果矮化砧木‘M26’中過(guò)量表達(dá)后，導(dǎo)致植株對(duì)ABA超敏感和其他一系列ABA相關(guān)的表型，如促進(jìn)了ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程，改變了很多ABA和脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，并且提高了植株對(duì)干旱脅迫的抗性。這表明，MpCYS4可能參與了ABA信號(hào)傳遞過(guò)程，通過(guò)促進(jìn)干旱脅迫下氣孔的關(guān)閉，調(diào)節(jié)ABA和干旱響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植株的抗旱性

7、。
　　4.MpCYS4基因也可以影響蘋(píng)果葉片自然衰老以及脅迫誘導(dǎo)的衰老過(guò)程中葉片的光合能力和葉片蛋白的含量和組成。其在蘋(píng)果矮化砧木‘M26’中過(guò)量表達(dá)后，能夠有效延緩葉片衰老過(guò)程中光合能力的下降和葉綠素的降解，抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，延遲葉片蛋白質(zhì)（尤其是Rubisco）的降解。而且，MpCYS4通過(guò)影響過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等抗氧化酶的活力，提高ROS的清除能力，緩解衰老過(guò)程

8、中的氧化損傷，保護(hù)植物細(xì)胞免受自由基的傷害。因此，MpCYS4不僅在蘋(píng)果非生物逆境脅迫應(yīng)答中具有重要功能，在蘋(píng)果葉片衰老過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。
　　5.通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)，我們篩選到與MpCYS4互作的蛋白MpFER。利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MpCYS4與MpFER的相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞膜上。MpFER編碼一個(gè)類(lèi)受體蛋白激酶(RLK)，與擬南芥FER高度同源。體外磷酸化試驗(yàn)表明，MpFER的活性受到MpCY

9、S4的影響。亞細(xì)胞定位分析表明，MpFER主要定位在細(xì)胞膜上。MpFER的表達(dá)也受到干旱和外源ABA的誘導(dǎo)，MpFER基因?qū)霐M南芥功能缺失突變體fer-4，可以恢復(fù)其對(duì)ABA超敏感的表型。因此，MpCYS4可能通過(guò)與MpFER互作參與蘋(píng)果干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程。
　　6.MpCYS5基因的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。MpCYS5體外純化的融合蛋白可以抑制木瓜蛋白酶的活性。該基因在擬南芥中異源表達(dá)可以提高植株對(duì)鹽脅迫的抗性，表現(xiàn)為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基