雙聯(lián)芐類化合物Riccardin D的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，由核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體。它以自身的RNA作為端粒脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid，DNA)復(fù)制模版，合成富含dGMP的DNA序列后，添加到染色體末端，并與端粒蛋白結(jié)合，保護(hù)染色體免于降解、端端融合、重排和丟失，維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。端粒酶在多數(shù)正常細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而在90％的腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)。因此，端粒酶被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的

2、標(biāo)志物，已經(jīng)成為腫瘤藥物設(shè)計(jì)與治療的靶點(diǎn)。
　　Riccardin D是從苔蘚類植物Dumortiera hirsuta分離所得的一種新型雙聯(lián)卞類化合物。前期研究表明，Riccardin D具有抑制腫瘤增殖作用，Riccardin D能在體內(nèi)外抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Riccardin D能顯著降低APCmin+基因小鼠小腸息肉及腺瘤的數(shù)量，表明Riccardin D具有化學(xué)預(yù)防和治療作用?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，本研究觀察Riccard

3、inD對(duì)腫瘤血管生成及端粒酶活性等方面的抑制作用，并探討其主要作用機(jī)制。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　1.Riccardin D對(duì)腫瘤微血管生成的抑制作用
　　實(shí)驗(yàn)方法:以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為靶細(xì)胞，以MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dip-henyltetrazoliu

4、m bromide，溴化-(4，5)-二甲基-2-噻唑基-2，5-二苯基四噻唑）法檢測(cè)了Riccardin D對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用。以劃痕法檢測(cè)了Riccardin D對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響。以3D Matrigel管形成法檢測(cè)Riccardin D對(duì)血管生成的抑制作用。以Western blot法檢測(cè)Riccardin D對(duì)HUVEC細(xì)胞中與血管生成相關(guān)蛋白VEGF、p-VEGFR2、EGFR、MMP-2表達(dá)水平的影

5、響。以Reversetranscription polymerase chain reaction（RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）法檢測(cè)Riccardin D對(duì)HUVEC細(xì)胞中VEGF、p-VEGFR2、EGFR、MMP-2 mRNA表達(dá)水平的影響。以RT-PCR法檢測(cè)Riccardin D對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞中VEGFmRNA表達(dá)水平的影響。將裸鼠接種人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞，20 mg/kgRiccardin D尾靜脈

6、注射給藥3周，每3天一次，20 mg/kg Etoposide作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，評(píng)價(jià)Riccardin D對(duì)非小細(xì)胞肺癌H460生長(zhǎng)的抑制作用。將瘤塊取出后，以免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)腫瘤組織中CD34表達(dá)水平，評(píng)價(jià)Riccardin D對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Riccardin D對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性的作用特點(diǎn)。以2.5-30μM Riccardin D作用HUVEC細(xì)胞

7、，其抑制率為2.2％至28.5％。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，Riccardin D能有效地抑制HUVEC細(xì)胞遷移。作用12 h及24 h后，Riccardin D對(duì)HUVEC細(xì)胞的遷移抑制率分別為95.0％和97.7％。Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)均顯示，Riccardin D顯著降低HUVEC細(xì)胞中EGFR、VEGF、p-VEGFR2和MMP-2表達(dá)水平。Riccardin D也能抑制非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)

8、。3D Matrigel結(jié)果顯示，Riccardin D能有效抑制HUVEC細(xì)胞形成毛細(xì)血管。以5、10、20μM Riccardin D與HUVEC細(xì)胞孵育18h，對(duì)于新生微血管分支形成的抑制率分別是78.7％、59.0％、29.5％。H460荷瘤裸鼠模型結(jié)果顯示，20 mg/kg Riccardin D抑制腫瘤生長(zhǎng)率為44.5％，裸鼠體重?zé)o明顯下降。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Riccardin D明顯抑制腫瘤組織CD34表達(dá)水平，腫

9、瘤組織中血管密度降低。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:Riccardin D具有抑制腫瘤微血管生成的作用。
　　2.Riccardin D對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用
　　實(shí)驗(yàn)方法:選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231，以TRAPeze(R)XL端粒酶活性檢測(cè)試劑盒法，檢測(cè)Riccardin D對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性影響。以Western blot及RT-PCR方法，檢測(cè)Riccardin D對(duì)腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織中端粒酶活

10、性關(guān)鍵蛋白hTERT蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)的影響。以Western blot及RT-PCR法，檢測(cè)Riccardin D對(duì)腫瘤細(xì)胞端粒保護(hù)蛋白TRF2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)影響。以免疫熒光染色及Western blot法，檢測(cè)Riccardin D對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志分子γ-H2AX的影響。以Western blot法，檢測(cè)Riccardin D對(duì)DNA損傷信號(hào)通路蛋白p-ATM、p-Chk2表達(dá)的影響。采用MTT法，檢測(cè)Ricca

11、rdin D對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響。通過建立裸鼠移植入乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231-D3H2LN腫瘤模型，評(píng)價(jià)Riccardin D對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)抑制作用。以異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/PI雙染、Western blot及原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法，研

12、究Riccardin D對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，對(duì)poly(ADP)ribose polymerase(PARP)、bax/bcl-2、cysteine-asparticacid proteases(Caspase)-3、Caspase-9等的調(diào)節(jié)作用。以流式細(xì)胞術(shù)及Western blot法，測(cè)定Riccardin D對(duì)人乳腺癌細(xì)胞周期及p53、p21等表達(dá)水平的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:TRAPeze(R)XL端粒酶活性檢測(cè)顯示

13、，Riccardin D以劑量依賴性作用方式下調(diào)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞端粒酶活性。Western blot顯示，Riccardin D顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞及腫瘤組織中hTERT蛋白表達(dá)。RT-PCR顯示，Riccardin D顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)。Western blot及RT-PCR顯示，Riccardin D下調(diào)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)

14、胞TRF2蛋白及mRNA表達(dá)水平。免疫熒光染色及Western blot顯示，Riccardin D作用后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中7-H2AX損傷灶形成增加，γ-H2AX蛋白表達(dá)升高。Western blot顯示，Riccardin D上調(diào)p-ATM、p-Chk2表達(dá)，激活DNA損傷信號(hào)通路。MTT顯示，Riccardin D對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231具有顯著抑制作用，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系。MCF

15、-7和MDA-MB-231-D3H2LN荷瘤裸鼠模型結(jié)果顯示，20 mg/kg Riccardin D對(duì)MCF-7腫瘤生長(zhǎng)抑制率為47.2％，對(duì)MDA-MB-231-D3H2LN腫瘤生長(zhǎng)抑制率38.5％，裸鼠體重?zé)o明顯下降。AnnexinV-FITC/PI顯示，20μM RiccardinD作用48 h，誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別為32.0％和22.1％。Western blot顯示，Riccardin D提高人

16、乳腺癌細(xì)胞PARP、Caspase-3、Caspase-9裂解活化程度及bax/bcl-2比例。流式細(xì)胞術(shù)顯示，Riccardin D將MCF-7細(xì)胞(p53-proficient)周期阻滯于G1期，MDA-MB-231細(xì)胞(p53-deficient)周期阻滯于G2/M期。Westem blot顯示RiccardinD上調(diào)MCF-7細(xì)胞p53和p21表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:Riccardin D下調(diào)MCF-7和MDA-MB-2