尿道下裂差異表達(dá)miRNA的篩選研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)篩選尿道下裂包皮組織中差異表達(dá)的miRNA，探討miRNA及其靶基因和信號(hào)通路在尿道下裂的發(fā)病機(jī)制中的作用，尋找尿道下裂預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　收集9例尿道下裂患兒及3例包莖患兒的包皮組織作為研究對(duì)象，其中3例尿道下裂患兒術(shù)前接受過(guò)HCG治療。分別在組織中抽提總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，利用丹麥Exiqon公司研制的芯片篩選差異性表達(dá)的miRNA，同時(shí)采用RT-PCR方法對(duì)芯片

2、結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì) miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因功能富集分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。探討總結(jié)與尿道下裂發(fā)病、治療和預(yù)后相關(guān)的miRNA及其調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果
　　1. miRNA芯片技術(shù)篩選結(jié)果：選擇差異倍數(shù)兩倍以上、P值<0.05的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行聚類分析。與包莖患兒比較，尿道下裂患兒包皮組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA共19個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA共15個(gè)。對(duì)尿道下

3、裂患兒術(shù)前是否應(yīng)用HCG治療也做了對(duì)比分析，術(shù)前應(yīng)用藥物較未應(yīng)用藥物患兒包皮組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA共25個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNA共19個(gè)。進(jìn)一步對(duì)所有包皮組織差異表達(dá)miRNA進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)部分miRNA形成在尿道下裂組低表達(dá)，而在包莖和尿道下裂術(shù)前應(yīng)用藥物治療組高表達(dá)。
　　2. RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果：選擇差異表達(dá)的10個(gè)miRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，其中5個(gè)miRNA得到驗(yàn)證，其差異表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果相符，分別為let

4、-7b-3p、miR-145-5p、miR-376a-3p、miR-377-3p、miR-1-3p。
　　3.生物信息學(xué)結(jié)果：let-7b-3p、miR-145-5p、miR-376a-3p、miR-377-3p、miR-1-3p可能與尿道下裂發(fā)病相關(guān)，靶基因?yàn)镾OX9、FGF14、FGFR2、TCF7L2、ZEB2、PAX3、SOD1、ZFPM2、THBS1、PAX6、SMAD4、DMRT2等，其功能與胚胎發(fā)育、腺體發(fā)育、性別分

5、化和傷口愈合等相關(guān)，相關(guān)信號(hào)通路為MAPK信號(hào)通路、TGFβ信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和前列腺癌相關(guān)信號(hào)通路等。
　　結(jié)論
　　1.首次建立尿道下裂miRNA基因表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)的miRNA，在尿道下裂與包莖、術(shù)前是否用藥物治療的尿道下裂間獲得差異表達(dá) miRNA，并推測(cè)miRNA表達(dá)趨勢(shì)。
　　2.通過(guò)構(gòu)建特異性莖環(huán)RT引物，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，驗(yàn)證了10個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中5個(gè)miRN