大鼠NAFLD形成中肝細(xì)胞增殖及部分肝切除術(shù)后肝再生的變化.pdf

1、目的目前非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)的發(fā)病率逐年升高，隨著對(duì)NAFLD研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)NAFLD不但會(huì)發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至可進(jìn)展為肝癌，同時(shí)，NAFLD患者在損傷、中毒、手術(shù)后肝臟再生的能力也可能下降。哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞絕大多數(shù)處于靜止期，病理狀況下如炎癥壞死、中毒損傷可誘導(dǎo)肝細(xì)胞快速增殖。NAFLD存在慢性氧應(yīng)激、反復(fù)發(fā)生的炎癥壞死、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子活化，這些

2、因素均是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要原因。在NAFLD是否也會(huì)引起肝細(xì)胞增殖呢?這種增殖又有何意義昵?氧應(yīng)激及胰島素抵抗被發(fā)現(xiàn)在其它組織如膀胱、乳腺、前列腺等的癌變發(fā)揮了重要的作用，而這種作用與二者可促進(jìn)細(xì)胞增殖密切相關(guān)。ROS本身就是一個(gè)重要的致癌物質(zhì)，它可引起基因突變和染色體修飾，誘導(dǎo)癌變。因此對(duì)NAFLD肝細(xì)胞增殖功能的研究就變得十分重要了，因?yàn)檫@種增殖除了可能僅為一種修復(fù)過程外，還可能與NAFLD的晚期事件肝癌相關(guān)。正常肝臟在物理、化學(xué)、

3、感染或缺血性損傷引起的肝細(xì)胞受損或肝臟體積下降時(shí)，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞快速再生增殖，以恢復(fù)肝臟原有的體積和功能。有報(bào)道顯示中～重度脂肪肝患者在損傷、手術(shù)及移植后肝臟再生能力下降，恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，并發(fā)癥增多，甚至可能出現(xiàn)肝功能衰竭，因此肝再生功能的改變對(duì)NAFLD患者損傷后的恢復(fù)是至關(guān)重要的。迄今為止對(duì)NAFLD再生功能的實(shí)驗(yàn)研究還較少，結(jié)果也不一致。本研究擬通過高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠作為動(dòng)物模型，研究NAFLD形成過程中肝細(xì)胞增殖功能的

4、變化及可能機(jī)制；同時(shí)對(duì)高脂喂養(yǎng)12W的NAFLD大鼠行70％部分肝切除術(shù)，觀察術(shù)后NAFLD大鼠肝再生功能的變化，并探討其相關(guān)的分子機(jī)制。 方法 1、動(dòng)物模型： (1)選用4周齡雄性Wistar大鼠，給予高脂飼料(組成為基礎(chǔ)飼料88％，豬油10％，膽固醇2％)，設(shè)立4W、8W、12W高脂喂養(yǎng)模型組(H組)，并設(shè)立同時(shí)相正常喂養(yǎng)組(N組)作為對(duì)照。 (2)選用4周齡雄性Wistar大鼠，高脂飼料喂養(yǎng)12W后

5、進(jìn)行70％部分肝切除術(shù)(切除左、中葉)，建立NAFLD大鼠肝再生模型組(F組)，設(shè)立術(shù)后0h、1h、12h、24h、36h五個(gè)時(shí)相點(diǎn)，并對(duì)正常大鼠進(jìn)行70％肝切除術(shù)設(shè)立同時(shí)相點(diǎn)正常肝再生組(C組)作為對(duì)照。 2、對(duì)高脂喂養(yǎng)模型組(H組)采用免疫組化染色法檢測(cè)PCNA的陽性表達(dá)率、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的PI及SPF值、RT-PCR及Western-blot檢測(cè)cyclinD1、P-ERK的表達(dá)，同時(shí)觀察肝臟大體形態(tài)、組織病理學(xué)改

6、變。 3、采用NAFLD大鼠肝再生模型(F組)，計(jì)算術(shù)后動(dòng)物存活率，在光鏡及透射電鏡下觀察殘肝組織病理學(xué)改變，計(jì)算再生肝重比及核分裂像計(jì)數(shù)，利用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)PCNA的表達(dá)、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的PI及SPF值、RT-PCR法檢測(cè)cyclinD1及c-fos的mRNA表達(dá)，Western-blot檢測(cè)cyclinD1、P-ERK、P21的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、成功地建立了高脂飼料喂養(yǎng)的NAFLD大鼠模

7、型，4W、8W時(shí)出現(xiàn)輕～中度脂肪肝的病理學(xué)改變；高脂喂養(yǎng)12W大鼠肝臟出現(xiàn)大小泡混合性脂肪變，脂變肝細(xì)胞達(dá)到70％左右，為中～重度脂肪肝，小葉及匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤，部分已演進(jìn)為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatosishepatitis，NASH)。 2、高脂喂養(yǎng)4W、8W組大鼠SPF、PI值與正常喂養(yǎng)組無明顯差異，PCNA陽性表達(dá)率及cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)較正常組也無明顯增高(P＞0.05)

8、；高脂喂養(yǎng)12W的NAFLD大鼠SPF、PI值、PCNA陽性表達(dá)率、cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)則明顯高于正常喂養(yǎng)組，有顯著性差異(P＜0.01)；H12W組P-ERK蛋白表達(dá)也顯著高于C12W組(P＜0.01)。 3、NAFLD大鼠部分肝切除術(shù)后殘肝的組織病理學(xué)改變顯示肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴沉積，肝竇狹窄迂曲，細(xì)胞核小，常染色質(zhì)少，核分裂像細(xì)胞少，線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見擴(kuò)張，可見大量溶酶體吞噬壞死細(xì)胞器碎片。術(shù)后24h、36

9、h可見少量處于有絲分裂期細(xì)胞，核分裂像計(jì)數(shù)明顯低于正常肝再生組； 4、NAFLD肝再生12h、24h、36h組動(dòng)物存活率分別為91.7％、75％、66.7％，正常肝再生組術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)的動(dòng)物存活率均為100％。NAFLD肝再生組在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)的再生肝重比及核分裂像計(jì)數(shù)均明顯低于正常肝再生組(P＜0.01)；PCNA的陽性表達(dá)率在術(shù)后12h、24h、36h均低于正常肝再生組(P＜0.01)，且表達(dá)的高峰較正常組延遲出現(xiàn)；流式細(xì)胞術(shù)檢

10、測(cè)PI及SPF值顯示F組在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均明顯低于C組(P＜0.01)。 7、NAFLD肝再生組cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平在術(shù)后24h、36h明顯低于正常肝再生組(P＜0.01)，且36h的表達(dá)較24h增高(P＜0.05)；P-ERK與P21在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)的蛋白表達(dá)均明顯高于正常肝再生組同時(shí)相點(diǎn)(P＜0.01)，術(shù)后24h達(dá)到峰值，二者的表達(dá)趨勢(shì)基本一致；c-fos在術(shù)后早期沒有被激活，表達(dá)高峰延遲至術(shù)后24h，且1

11、2h后的活化水平明顯高于正常肝再生組同時(shí)相點(diǎn)(P＜0.01)。 結(jié)論： 1、高脂喂養(yǎng)4W、8W的輕～中度NAFLD大鼠肝細(xì)胞增殖功能未發(fā)生變化，而高脂喂養(yǎng)12W時(shí)肝臟呈中～重度脂變，部分出現(xiàn)NASH表現(xiàn)，此時(shí)大鼠肝細(xì)胞增殖活躍。 2、高脂喂養(yǎng)12W時(shí)大鼠肝組織內(nèi)ERK等激酶的活化增加，cyclinD1表達(dá)明顯增高，P-ERK促進(jìn)了cyclinD1表達(dá)。 3、高脂飼料誘導(dǎo)的中～重度NAFLD大鼠進(jìn)行70％部