旋毛蟲四種絲氨酸蛋白酶抑制劑轉錄水平的表達和蟲體定位的研究.pdf

1、旋毛蟲是一種全球范圍分布的危害嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病。主要發(fā)病原因是因為宿主食用了生的或未熟的含有感染性包囊的肉類食品而感染，感染嚴重時可致死亡。幾乎所有的哺乳動物均可以被感染。近年相繼在幾種寄生蟲分離并鑒定除了絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑具有獨特的酶抑制活性，能夠保護寄生蟲抵制宿主消化液的消化，參與寄生蟲在宿主體內(nèi)的移行過程，能夠利于寄生性線蟲的發(fā)育并抵抗宿主的免疫反應。
　　根據(jù)NCBI上已發(fā)表的

2、旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑TspAd5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548（其基因序列登錄號分別為:EU263307、AF231948.1、XM_003379333、XM_003379851）設計實時熒光定量引物，應用分子生物學技術分別將克隆的目的片段與pMD-18T克隆載體連接后，各自轉化入克隆感受態(tài)細胞DH5α中。經(jīng)菌液PCR鑒定和測序公司測序后對克隆到的序列進行序列分析正確，隨后制備相應的標準品，并建立相對應的實時熒光

3、定量標準曲線。
　　為闡明四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內(nèi)轉錄水平表達量的情況，將收集的不同時期的旋毛蟲蟲體提取總RNA進行RT-PCR，分析不同發(fā)育時期里旋毛蟲四種Ts-SPI基因在mRNA水平的表達量差異。結果顯示，TspAd5和TS11-1在旋毛蟲感染后3d的成蟲期出現(xiàn)一個轉錄高峰，3d時表達量明顯高于1d和5d的表達量(p＜0.01)，5d時較NBL略低(p＜0.05);成囊前期，表達量很低，其中18d時表達量最

4、低(p＜0.05);另一高峰出現(xiàn)在感染后第38天的肌幼蟲時期，且差異具有顯著性(p＜0.05)。Tsp03044在成蟲時期，3d時的轉錄水平表達量明顯高于其他時期的表達量且差異具有極顯著性(p＜0.01);成囊前期中18d時表達量最低(p＜0.05)，22d時轉錄出現(xiàn)高峰(p＜0.01)，差異極顯著。Tsp03548在3d時轉錄略高于1d和5d的表達量(p＜0.05)，5d時較NBL略低(p＜0.05)且具有差異顯著性;成囊前期中18d

5、時出現(xiàn)轉錄表高峰(p＜0.01);肌幼蟲時期均有表達(p＜0.05)且差異顯著。
　　本實驗應用免疫熒光技術研究四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內(nèi)分布的情況，并對四種Ts-SPI與宿主的相互作用進行分析。免疫熒光定位結果顯示，TspAd5和TS11-1在成蟲表皮組織和肌肉蟲的表皮和體內(nèi)均大量表達，在新生幼蟲和成囊前期幼蟲的蟲體也有表達。Tsp03044在新生幼蟲的蟲體的體內(nèi)和表皮表達量略少，在其他時期的體內(nèi)均明顯可見其紅色

6、熒光效果顯著。Tsp03548明顯可見定位于成囊前期幼蟲的表皮組織和體內(nèi);成蟲的表皮組織和新生幼蟲的蟲體的表皮和體內(nèi)也有表達，但整體紅色熒光效果很弱;肌幼蟲的體內(nèi)和表皮也均有表達。
　　本實驗對四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內(nèi)轉錄水平表達量和蟲體分布的情況進行研究，通過應用實時熒光定量PCR和免疫熒光定位技術對TspAd5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548在不同發(fā)育時期轉錄水平表達量變化和蟲體表達部位的進