低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）在喉鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義的研究.pdf

1、缺氧是人類(lèi)和動(dòng)物實(shí)體腫瘤的一個(gè)共同特征。低氧誘導(dǎo)因子1a(hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)是機(jī)體在低氧條件下產(chǎn)生的一轉(zhuǎn)錄活化因子，它能指導(dǎo)多種低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，為機(jī)體適應(yīng)低氧，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要因素。當(dāng)周?chē)h(huán)境的氧濃度下降時(shí)，HIF-1α表達(dá)增加，并且其表達(dá)增加表現(xiàn)在多個(gè)水平上，包括轉(zhuǎn)錄和蛋白等水平，但主要是蛋白水平明顯增多。HIF-1α是HIF-1的一個(gè)亞基，是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，HIF-1α的

2、活性是HIF-1的決定性成分，其活性對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管形成以及促進(jìn)腫瘤的增殖生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要作用，并受多種因子的調(diào)控和影響。在多種惡性腫瘤中都存在HIF-Ⅰα蛋白的過(guò)表達(dá)，并與預(yù)后不良密切相關(guān)。HIF-1α與腫瘤的關(guān)系已成為近年來(lái)腫瘤學(xué)研究中的一個(gè)新的熱點(diǎn)。有關(guān)HIF-1α與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先從人喉鱗癌實(shí)體瘤入手，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)了解缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)極其相

3、關(guān)調(diào)控因子與喉鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系；進(jìn)而通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)，從分子水平探討低氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)及其相關(guān)調(diào)控因子在頭頸腫瘤中的表達(dá)及相互作用機(jī)制，進(jìn)一步明確HIF-1α與化療抵抗的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行靶向HIF-1α活性及表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，深入探討以缺氧為靶點(diǎn)對(duì)治療頭頸腫瘤及化療增敏的潛在臨床價(jià)值。 方法： 1HIF-1α在喉鱗癌中的表達(dá)及其與喉鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系。標(biāo)本選自河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室2001年

4、1月1日-2004年12月31日術(shù)前未經(jīng)治療的喉聲門(mén)上型癌、喉咽癌病人63例標(biāo)本，其中男59例，女4例；中位年齡56歲(43～72歲)。根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)標(biāo)準(zhǔn)(1997)確定TNM分期。喉癌分型：喉聲門(mén)上型癌42例，喉咽癌21例；臨床分期：Ⅰ期8例Ⅱ期11例、Ⅲ期14例、Ⅳ期30例；病理學(xué)分級(jí)：鱗癌Ⅰ級(jí)15例，鱗癌Ⅱ級(jí)29例、鱗癌Ⅲ級(jí)19例；病理證實(shí)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組41例，無(wú)轉(zhuǎn)移組22例。取癌旁正常粘膜組織20例作為對(duì)照。所有

5、標(biāo)本均一部分迅速置于液氮罐中保存，一部分標(biāo)本離體后2小時(shí)內(nèi)放入10％中性福爾馬林中固定24小時(shí)，石蠟包埋，常規(guī)病理HE染色，所有標(biāo)本均經(jīng)兩位副高以上職稱(chēng)的病理科醫(yī)生確定病理性質(zhì)和病理學(xué)分級(jí)。腫瘤組織均病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，喉癌旁正常粘膜病理為正常喉組織。 1.1免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)喉鱗癌63例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中病理證實(shí)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組41例，無(wú)轉(zhuǎn)移組22例。取癌旁正常粘膜組織20例作為對(duì)照。指標(biāo)為HIF-1α、VEGF、P53

6、。結(jié)果判定：每例標(biāo)本以400倍光鏡下隨意選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)求其陽(yáng)性百分率作為結(jié)果。平均陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≤5％判定為陰性，陽(yáng)性染色細(xì)胞＞5％判定為陽(yáng)性。 1.2流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)移組患者的原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶以及非轉(zhuǎn)移組標(biāo)本檢測(cè)HIF-1α、VEGF、P53蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，取石蠟標(biāo)本切片(40μm厚)，網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞樣品。在對(duì)蛋白免疫熒光標(biāo)記物測(cè)定時(shí)，設(shè)一抗或二抗的本底對(duì)照

7、和陰性對(duì)照。采用美國(guó)BeckmanCoulter公司生產(chǎn)地Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)含量，F(xiàn)I=(瘤細(xì)胞表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)。熒光指數(shù)(FI)可相對(duì)客觀的反映蛋白的表達(dá)程度。 1.3用TrizolReagant進(jìn)行組織總RNA提取，采用RT-PCR試劑盒對(duì)提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在紫外凝膠投射分析系統(tǒng)中

8、照相分析，分別比較HIF-1αmRNA在喉鱗癌組織和癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)水平，分析其基因表達(dá)調(diào)控水平。 2低氧對(duì)喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2HIF-1α及其相關(guān)基因表達(dá)的影響：人喉鱗癌細(xì)胞Hep-2分成3組：缺氧12h組、缺氧24h組及對(duì)照組。缺氧組分別在缺氧條件下(37℃，5％CO2，2％O2飽和度)培養(yǎng)12h和24h，對(duì)照組置于正常氧濃度條件下(37℃，5％CO2、21％O2飽和度)培養(yǎng)24h。流式細(xì)胞儀分別測(cè)定3組細(xì)胞周期及

9、HIF-1α、突變型P53、VEGF表達(dá)，免疫組織化學(xué)SP法分別測(cè)定3組細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、P53、VEGF表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1αmRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1HIF-1α在喉鱗癌中的表達(dá)及其與喉鱗癌生物學(xué)行為的關(guān)系。 1.1免疫組化染色結(jié)果顯示(1)HIF-1α蛋白在癌旁正常喉黏膜中幾乎無(wú)表達(dá)，在喉鱗癌組織中主要于細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)致密濃染的棕色顆粒，部分切片顯示其在胞漿及胞

10、核中均有表達(dá)。(2)有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α蛋白表達(dá)(82.9％)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(54.5％)(P＜0.05)。(3)HIF-1α蛋白表達(dá)與喉鱗癌病理分級(jí)及臨床分期相關(guān)。(4)喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中原發(fā)灶HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為82.9％低于其淋巴結(jié)表達(dá)的陽(yáng)性率95.1％，但經(jīng)X2檢驗(yàn)二者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。(5)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶HIF-1α蛋白表達(dá)與喉癌、下咽癌臨床分期和病理分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)；轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)HIF

11、-1α蛋白表達(dá)與喉癌、下咽癌臨床分期及病理分級(jí)均無(wú)關(guān)(P＞0.05)。(6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、P53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(70.7％，68.3％)高于非轉(zhuǎn)移組(40.9％，36.4％)(P＜0.05)；⑦喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)VEGF、P53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(87.8％，80.5％)均高于其原發(fā)灶(70.7％，68.3％)，但經(jīng)X2檢驗(yàn)二者無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 1.2流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)移組患者的原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶以及非

12、轉(zhuǎn)移組標(biāo)本檢測(cè)HIF-1α、VEGF、P53，結(jié)果顯示(1)轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組腫瘤細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的平均FI分別為5.33±0.16和2.27±0.18，t檢驗(yàn)顯示兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.36，P＜0.05)。(2)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶與其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)腫瘤細(xì)胞HIF-1α蛋白的平均FI分別為5.33±0.16和10.53±1.1，配對(duì)t檢驗(yàn)顯示兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.36，P＜0.05)。(3)喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、

13、P53蛋白表達(dá)的平均FI高于非轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。(4)經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析，非轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組HIF-1α與VEGF表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.715，0.883,P＜0.05)，HIF-1α與P53表達(dá)亦呈正相關(guān)(r=0.725,0.852，P＜0.05)。(5)喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶與其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)VEGF、P53蛋白表達(dá)平均FI轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)均高于原發(fā)灶，P＜0.05。(6)在喉鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶與其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中HIF-1

14、α與VEGF表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.715,0.686,P＜0.05)，HIF-1α與P53表達(dá)亦呈正相關(guān)(r=0.755,0.823,P＜0.05)。 1.3RT-PCR檢測(cè)HIF-1αmRNA在喉癌組織中的表達(dá)，在63例喉鱗狀細(xì)胞癌中有46例HIF-1αmRNA呈陽(yáng)性表達(dá)，在487bp處可見(jiàn)清晰條帶，在20例正常喉粘膜組織中16例HIF-1αmRNA呈陽(yáng)性表達(dá)，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著差異。 2低氧對(duì)喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2

15、HIF-1α及其相關(guān)基因表達(dá)的影響 2.1免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)低氧組Hep2細(xì)胞胞漿中呈陽(yáng)性表達(dá)，且隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)。 2.2缺氧12h組、缺氧24h組及對(duì)照組HIF-1α免疫熒光指數(shù)分別為：1.69±1.21，5.83±1.28，0.22±0.07；上述三組P53免疫熒光指數(shù)分別為：2.75±0.02，5.27±0.07，1.15±0.01；上述三組VEGF免疫熒光指數(shù)分別為：4.85±0.03，10.37±

16、0.2，2.15±0.06；經(jīng)F檢驗(yàn)，3組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。 2.3流式細(xì)胞儀測(cè)定缺氧組HIF-1α與P53表達(dá)呈明顯正相關(guān)性(r=0.715,P＜0.05)，HIF-1α與VEGF表達(dá)呈明顯正相關(guān)性(r=0.925，P＜0.05)。 結(jié)論： 1應(yīng)用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、RT-PCR技術(shù)對(duì)人喉鱗癌63例標(biāo)本分別從HIF-1α蛋白表達(dá)水平定性、定位及定量、HIF-1α基因水平表達(dá)等不同側(cè)面

17、研究表明，HIF-1α與喉鱗癌轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理分級(jí)密切相關(guān)，并在腫瘤血管生成以及篩選抗凋亡細(xì)胞中與VEGF、P53等相關(guān)調(diào)控因子協(xié)同作用促進(jìn)了腫瘤發(fā)展的惡性進(jìn)程。尤其是腫瘤乏氧情況下，P53基因突變或缺失時(shí)可增加癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥誘導(dǎo)的凋亡的耐受力，因此推測(cè)乏氧以及乏氧造成的P53基因突變率增加是造成喉鱗癌細(xì)胞治療抵抗的重要影響因素，這—研究結(jié)果為進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)探討喉鱗癌治療抵抗機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。 2體外低氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺氧