糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織CTGF、VEGF、TGF-β-,2-作用機(jī)制和CTGFsiRNA的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景和目的： 糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最嚴(yán)重和常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥之一，是50歲以上人群的重要致盲眼病。近年來(lái)糖尿病的發(fā)病率顯著上升，其中在發(fā)展中國(guó)家的增長(zhǎng)速度要遠(yuǎn)大于其他國(guó)家。其發(fā)病率高達(dá)38％—90％，現(xiàn)已引起人們廣泛重視。糖尿病因糖代謝障礙致全身各組織器官的微血管異常，在眼部可引起視網(wǎng)膜缺血缺氧，新生血管形成，纖維增殖等以致視網(wǎng)膜脫離，甚至導(dǎo)致喪失視失。DR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜

2、，至今尚未完全闡明。細(xì)胞因子在DR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。其中新近發(fā)現(xiàn)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)引起了許多學(xué)者的關(guān)注，CTGF為CCN(CTGF/fisp12，Cef10/cry61，Nov，CCN)家族成員之一，為單體分泌性多肽。CTGF廣泛存在于人類多種組織器官中，它具有促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)有絲分裂和細(xì)胞增生，趨化細(xì)胞等作用。近年來(lái)的研究

3、顯示CTGF參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制。與CTGF密切相關(guān)的細(xì)胞因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)等，它們?cè)贑TGF的作用過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，CTGF蛋白可與VEGF蛋白連接，相互作用影響新生血管形成；同時(shí)CTGF被認(rèn)為是TGF-β2的下游效應(yīng)介質(zhì)；TGF-β2可誘導(dǎo)

4、CTGF和VEGF表達(dá)增加；TGF-β2可通過(guò)MAPK和PKC途徑使VEGF表達(dá)增加。另外，細(xì)胞凋亡在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中起了很重要的作用。細(xì)胞凋亡存在于糖尿病視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，光感受器細(xì)胞層和內(nèi)核層。在糖尿病患者中，視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞凋亡的程度明顯高于非糖尿病者。多元醇通路的激活，山梨糖醇聚集可影響視網(wǎng)膜的功能，氧化損傷、糖基化終產(chǎn)物的形成可能對(duì)視網(wǎng)膜產(chǎn)生毒性作用，通過(guò)非酶糖基化途徑誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。RNA干擾(RNA int

5、erference，RNAi)技術(shù)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強(qiáng)大工具，已證實(shí)其為化學(xué)合成長(zhǎng)21～23個(gè)核苷酸的小分子RNA(small interfered RNA，siRNA)，能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)外介導(dǎo)同源基因沉默。siRNA作為一種新方法可以用來(lái)研究在各種組織中基因產(chǎn)物的功能。總之，到目前為此，雖然取得了諸多的進(jìn)展，但各因子間的關(guān)系并不十分清楚，DR還是嚴(yán)重威脅人們視力的疾病，也不能完全地預(yù)防及治療，因此需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究。對(duì)三種細(xì)胞

6、因子的深入研究，有利于破解糖尿病視網(wǎng)膜中微血管病變的發(fā)生機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)以CTGF為主線，利用CTGF小干擾RNA技術(shù)的干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中CTGF、VEGF和TGF-β2蛋白和基因的表達(dá)，細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，來(lái)分析三因子在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的作用機(jī)制，以求尋找到防治DR的新策略。 方法： 利用STZ誘導(dǎo)形成糖尿病大鼠模型。Wistar大鼠，體重為180-220g，240只。腹腔注射1％STZ溶液，劑量為60mg

7、/kg。連續(xù)三天尿糖在+++以上，72小時(shí)后取大鼠尾靜脈檢測(cè)血糖，血糖值大于16.7mmol/L，為糖尿病大鼠造模成功。所有大鼠分為對(duì)照組，糖尿病4周、8周、12周、16周、24周組和干預(yù)組(糖尿病16周)。干預(yù)組為糖尿病16周時(shí)給予CTGFsiRNA玻璃體腔注射。 視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)，HE染色光鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)。應(yīng)用RT-PCR和Western—Blot方法檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)CTGF、VEGF和TGF-β

8、2基因和蛋白的表達(dá)；免疫組化觀察以上三因子在視網(wǎng)膜內(nèi)的分布情況。應(yīng)用TUNEL方法檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞凋亡的表達(dá)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括兩組資料之間比較的t檢驗(yàn)和相關(guān)分析。 結(jié)果： 成功建立了STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。成功率為97.50％。在糖尿病16周以前，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)規(guī)則，血管走行良好與對(duì)照組無(wú)顯著差異。到24周時(shí)，可見(jiàn)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則，水腫，細(xì)胞排列

9、紊亂，有部分細(xì)胞突出于內(nèi)界膜；視網(wǎng)膜血管主干較為僵硬變窄，但未見(jiàn)缺血區(qū)及新生血管形成。細(xì)胞凋亡表達(dá)在糖尿病4周就已出現(xiàn)，并逐漸增強(qiáng)。CTGF，VEGF和TGF-β2的表達(dá)水平在糖尿病視網(wǎng)膜內(nèi)明顯增強(qiáng)。CTGF開始于糖尿病8周，主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；VEGF和TGF-β2則在糖尿病12周時(shí)開始表達(dá)增強(qiáng)，CTGF的表達(dá)增強(qiáng)早于VEGF和TGF-β2；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著病程的延長(zhǎng)，三因子的表達(dá)逐漸增強(qiáng)；到糖尿病24

10、周時(shí)，三因子均達(dá)到表達(dá)均最強(qiáng)，在視網(wǎng)膜各層均可見(jiàn)免疫染色的蛋白。CTGFsiRNA在干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)造成了CTGF基因的沉默，干擾效率為54.46％，CTGF蛋白的干擾效率為45.11％，同時(shí)也使VEGF、TGF-β2 mRNA及其蛋白表達(dá)明顯減弱，細(xì)胞凋亡表達(dá)也明顯減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異具有顯著性意義(P<0.05)。我們發(fā)現(xiàn)在糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)CTGF與VEGF(P<0.05)，CTGF與TGF-β2(P<0.05)，VEGF與T

11、GF-β2(P<0.01)之間，以及三種因子與細(xì)胞凋亡的表達(dá)(P<0.01)之間呈明顯的正相關(guān)性。 結(jié)論： 本研究成功建立了糖尿病大鼠模型，在糖尿病早期視網(wǎng)膜內(nèi)可見(jiàn)血管及網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，但出現(xiàn)了逐漸增多的凋亡細(xì)胞，最早發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，之后出現(xiàn)于內(nèi)核層及外核層，到糖尿病24周時(shí)出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管變窄及僵硬，網(wǎng)膜水腫及細(xì)胞排列不規(guī)則等病變。這表明糖尿病早期視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的發(fā)生要早于血管病變的發(fā)生。糖尿病可促使大鼠

12、視網(wǎng)膜內(nèi)的CTGF表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)也上調(diào)了視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF和TGF-β2的表達(dá)，并參與了視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。CTGF的表達(dá)增強(qiáng)的發(fā)生早于VEGF和TGF-β2的表達(dá)。說(shuō)明CTGF在三因子的相互作用中占了主要地位。CTGFsiRNA沉默了CTGF基因的表達(dá)，使VEGF、TGF-β2蛋白和基因表達(dá)也明顯下降，并使糖尿病視網(wǎng)膜內(nèi)的細(xì)胞凋亡表達(dá)出現(xiàn)減弱趨勢(shì)。總之，CTGF，VEGF和TGF-β2三者在糖尿病早期視網(wǎng)膜中發(fā)揮了重要作用。CTGFs