煙草和水稻病程相關(guān)蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、植物在受到一些化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)、鹽害、病原物(如真菌、細(xì)菌、病毒)的侵染等逆境脅迫時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列防衛(wèi)反應(yīng)，往往產(chǎn)生出一些新的蛋白質(zhì)，即所謂的病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PRP)。根據(jù)最新的研究結(jié)果可知，PR蛋白可分為PR1、PR2、PR3、PR4等共17類，除PR1與抗真菌的關(guān)系比較密切外，其它PR蛋白的生物學(xué)功能，如抗鹽、抗病毒等都有不同的報(bào)道。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)不同的PR蛋白基因進(jìn)行功能分析，

2、特別是其在抗病方面的研究已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本研究在克隆煙草病程相關(guān)蛋白PR1b基因(NCPR1b)、PR4a基因(NCPR4a)、水稻RSOsPR10基因(RSOsPR10)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了不同類型的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了普通煙草(NicotianatabacumNC89)、三生煙草(NicotianatabacumL.cvSamsun)，獲得了一系列轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因煙草的T1代植株進(jìn)行了抗鹽、抗病等生物學(xué)

3、功能分析。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.根據(jù)已報(bào)道基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR，從普通煙NC89中克隆得到NCPR1b基因、NCPR4a基因，cDNA大小分別為506bp、460bp；從水稻(中花11)中克隆得到RSOsPR10基因，cDNA大小為586bp。 2.構(gòu)建了含NCPR1b基因的三種植物表達(dá)載體，即含正義NCPR1b基因的載體pBI-Z-PR1b、含反義NCPR1b基因的載體pBI-F-PR1b、含有核基質(zhì)結(jié)合序

4、列(MAR)的正義NCPR1b基因載體pMR-PR1b；構(gòu)建了含正義NCPR4a基因的載體pBI-PR4a；構(gòu)建了含正義RSOsPR10基因的載體pROKⅡ-PR10。 3.以普通煙草NC89為轉(zhuǎn)化受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將pBI-Z-PR1b和pBI-PR4a分別轉(zhuǎn)化，獲得了兩類轉(zhuǎn)基因煙草植株，即含有pBI-Z-PR1b的轉(zhuǎn)基因NC89(T-1)，含有pBI-PR4a的轉(zhuǎn)基因NC89(T-4)；以三生煙草為轉(zhuǎn)化受體，采用農(nóng)

5、桿菌介導(dǎo)的方法，分別將NCPR1b基因的三種植物表達(dá)載體、正義NCPR4a基因的載體、正義RSOsPR10基因的載體轉(zhuǎn)化，獲得了五類轉(zhuǎn)基因煙草植株，即含有pBI-Z-PR1b的轉(zhuǎn)基因煙草(X-Z)，含有pBI-F-PR1b的轉(zhuǎn)基因煙草(X-F)，含有pMR-PR1b的轉(zhuǎn)基因煙草(X-M)，含有pBI-PR4a的轉(zhuǎn)基因煙草(X-4)，含有pROKⅡ-PR10的轉(zhuǎn)基因煙草(X-10)。同時(shí)將空載體pBl121、pROKⅡ轉(zhuǎn)化NC89和三生煙

6、，獲得再生煙草，在實(shí)驗(yàn)中做為對(duì)照。 4.Northernblot分析鑒定出了上述載體的轉(zhuǎn)基因植株；NCPR1b基因在野生煙草中的表達(dá)受水楊酸(SA)誘導(dǎo)，NCPR1b基因不同表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植株在SA誘導(dǎo)下，NCPR1b基因的表達(dá)確實(shí)表現(xiàn)出理論上的差異。RSOsPR10基因在野生水稻中的表達(dá)存在組織差異性，100mMNaCl誘導(dǎo)處理后，其在水稻根部表達(dá)量要高于葉片。 5.轉(zhuǎn)pBI-Z-PR1b、pMR-PR1b和正義pR

7、OKⅡ-PR10的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出明顯的抗鹽能力，100mMNaCl處理的條件下pBI-Z-PR1b、pMR-PR1b轉(zhuǎn)基因植株仍生長旺盛、根部細(xì)長，而非轉(zhuǎn)基因植株黃化、根部短小；pROKⅡ-PR10的轉(zhuǎn)基因煙草中RSOsPR10的過量表達(dá)加快了T1代種子萌發(fā)。 6.煙草赤星病原菌侵染后，轉(zhuǎn)pBI-Z-PR1b、pMR-PR1b、正義pBI-PR4a的轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力高于對(duì)照植株。 7.病毒TMV侵染后，不同NCPR