無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷遺傳性疾病的生物芯片的研究.pdf

1、本文對無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷遺傳性疾病的生物芯片進(jìn)行了研究。目的：建立具有實(shí)用價(jià)值的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷遺傳病的生物芯片微型全分析系統(tǒng)，擬將胎兒有核紅細(xì)胞的富集，胎兒遺傳物質(zhì)的擴(kuò)增和遺傳病診斷三個部分有機(jī)組合，實(shí)現(xiàn)整個分析過程的自動化、微型化，從而減少資源浪費(fèi)和避免結(jié)果的污染。現(xiàn)階段我們結(jié)合無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷僅對樣本制備、生化反應(yīng)、結(jié)果診斷三個獨(dú)立環(huán)節(jié)進(jìn)行初步的研究和優(yōu)化，具體目的是：1.樣本制備方面，嘗試在提高自孕婦外周血中富集胎兒細(xì)胞效率的同時(shí)，繞過

2、儀器微型化中最難克服的離心問題，使胎兒細(xì)胞的富集過程易于實(shí)現(xiàn)自動化和微型化；2.生化反應(yīng)方面，以非微加工形式構(gòu)建芯片PCR的反應(yīng)腔體，降低制作成本，使其與溫控系統(tǒng)整合后更利于普及應(yīng)用；3.結(jié)果檢測方面，擬構(gòu)建固相PCR(solidphase-PCR，SP-PCR)診斷芯片，并對芯片的構(gòu)建條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。最終，以缺失型杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)為模型，初步建立無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷生物芯片的技術(shù)

3、平臺。 方法：1.建立孕婦外周血胎兒有核紅細(xì)胞的高效富集系統(tǒng)：首先，建立孕婦外周血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停源四Ｐ痛_定合適的紅細(xì)胞凝集劑濃度，比較抗體CD50和CD45在去除白細(xì)胞和富集有核紅細(xì)胞(nucleatedredbloodcells，NRBC)方面的差異。然后，采用合適濃度的紅細(xì)胞凝集劑和CD50抗體去除孕婦血中的白細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞，再用微加工制作的微型硅膜過濾芯片，以細(xì)胞直徑的差異，進(jìn)一步去除紅細(xì)胞得到胎兒有核紅細(xì)胞。最后，分別用

4、模擬孕婦外周血和真實(shí)孕婦外周血比較新建方法和常用方法對NRBC的富集效率和白細(xì)胞/紅細(xì)胞的清除率。 2.實(shí)現(xiàn)胎兒單細(xì)胞芯片全基因組擴(kuò)增：借鑒原位PCR的密封圈和芯片實(shí)驗(yàn)室常用的玻片構(gòu)建PCR芯片反應(yīng)腔體，驗(yàn)證構(gòu)建的腔體與PCR的材料相容性。利用優(yōu)化的表面處理劑BSA濃度和所加酶量等條件確定擴(kuò)增的檢測底限。凝膠純化后測定芯片單細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增產(chǎn)量，并以此為模板進(jìn)行多種基因的再次擴(kuò)增，初步驗(yàn)證產(chǎn)物的均勻性和可用性。 3.構(gòu)

5、建缺失型DMDSP-PCR診斷芯片：構(gòu)建SP-PCR診斷芯片，利用人工合成的寡核苷酸進(jìn)行原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；并對構(gòu)建芯片片基上探針的耐熱性、點(diǎn)樣探針濃度、探針連接臂長度和探針固定的紫外交聯(lián)強(qiáng)度等因素進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化和選擇。以缺失型DMD為模型，構(gòu)建SP-PCR診斷芯片，同時(shí)構(gòu)建DMD寡核苷酸芯片對SP-PCR芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。最終用DMDSP-PCR芯片和寡核苷酸芯片檢驗(yàn)一例DMD外顯子13缺失的胎兒全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物。初步驗(yàn)證構(gòu)建的SP-PCR芯

6、片的臨床實(shí)用性。 結(jié)果：1.樣品制備部分：(1)通過連續(xù)濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定最適宜的紅細(xì)胞凝集劑的濃度是2％，該濃度可使在成熟紅細(xì)胞凝集的同時(shí)最大限度地避免NRBC的丟失。(2)采用CD50抗體比常用的CD45抗體可以減少10～15％的NRBC的損失率，二者具有相同的白細(xì)胞去除率。(3)新建的胎兒細(xì)胞富集方法的富集效率可達(dá)65％以上，而常用方法僅有不足30％，二種富集方法得到的有核細(xì)胞數(shù)均為105～6。真實(shí)孕婦外周血樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

7、示：新建富集方法較常用方法每份(10ml)平均多獲得93.5個NRBCs。 2.生化反應(yīng)部分：(1)由玻璃、塑料蓋玻片、GeneFrame雙面膠框組成的PCR芯片腔體內(nèi)表面對反應(yīng)沒有抑制。(2)在構(gòu)建的芯片PCR反應(yīng)腔體內(nèi)對簡并寡核苷酸擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化后表明，反應(yīng)體系中加入2.5UAmpliTaqGold酶及1.0％BSA時(shí)的擴(kuò)增效果最好。(3)采用該體系實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞芯片的簡并寡核苷酸擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約在200-2000bp范

8、圍，擴(kuò)增效率為101。利用該產(chǎn)物為模板可以再次進(jìn)行多個基因的檢測。 3.結(jié)果檢測部分：(1)PLL玻片和醛基玻片對固定探針耐熱性的比較顯示PLL玻片好于醛基玻片，確定實(shí)驗(yàn)采用PLL芯片作為基片。(2)構(gòu)建SP-PCR芯片的紫外交聯(lián)、探針連接臂長度和探針點(diǎn)樣濃度的最佳實(shí)驗(yàn)條件分別是180mJ、25個T和20μmol/L。(3)構(gòu)建了檢測DMD9個外顯子缺失的SP-PCR芯片，并對一例DMD外顯子13缺失的胎兒細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，其結(jié)

9、果與寡核苷酸對照芯片及臨床診斷完全一致。 結(jié)論：1.新建一種自孕婦外周血中富集胎兒有核紅細(xì)胞的方法，該方法避免離心步驟，使用CD50抗體去除白細(xì)胞，采用微型硅膜過濾芯片過濾成熟紅細(xì)胞，與常用方法相比具有高效、快速及易于實(shí)現(xiàn)微型化和自動化的優(yōu)勢。2.可以在非微加工形式的芯片PCR反應(yīng)腔體中實(shí)現(xiàn)胎兒單細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增效率達(dá)101，擴(kuò)增產(chǎn)物可以做為后續(xù)遺傳學(xué)分析的模板。該腔體易于與溫控系統(tǒng)整合為PCR芯片。3.根據(jù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條