小鼠內(nèi)皮抑素基因突變體的構(gòu)建及其功能的初步研究.pdf

1、該研究在克隆基因設(shè)計(jì)引物時(shí),選擇性的去除內(nèi)皮抑素C末端13個(gè)氨基酸(LCIENSFMISFSK)相對(duì)應(yīng)的堿基序列,得到內(nèi)皮抑素的一個(gè)突變體,命名為EM13.用基因工程的方法構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-N<,2>-EM<,13>和pEGFP-N<,2>-Endostatin,將兩者轉(zhuǎn)入肝癌腹水瘤H22細(xì)胞中并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),從而達(dá)到研究C末端去除是否影響內(nèi)皮抑素生物學(xué)作用的目的.為此作了以下工作:1.從小鼠肝臟組織中提取總RNA,設(shè)計(jì)合成

2、一對(duì)特異性引物,分別帶有Xho Ⅰ和Sac Ⅱ的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn).RT-PCR法擴(kuò)增EM13基因片段,并引入上述兩個(gè)酶切位點(diǎn).2.將RT-PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體相連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,篩選出陽(yáng)性克隆,并以雙脫氧末端終止法對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-EM13進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明與已知小鼠內(nèi)皮抑素基因序列一致.3.用XhoⅠ和SacⅡ酶切此測(cè)序載體,將目的條帶回收純化,將其插入到質(zhì)粒載體pEGFP-N<,2>相應(yīng)的酶切位點(diǎn)

3、上,構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-N<,2>-EM13,同時(shí)構(gòu)建表達(dá)載體pEGFP-N<,2>-Endostatin.4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌腹水瘤H22細(xì)胞中,并將篩選后的H22細(xì)胞接種于Balb/c純系小鼠皮下,觀察內(nèi)皮抑素和EM13對(duì)H22細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的影響.結(jié)果表明轉(zhuǎn)Endostatin組小鼠的瘤體重量與未轉(zhuǎn)染組的差異雖未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但明顯減輕.且腫瘤組織血管密度相對(duì)較低,說明轉(zhuǎn)Endostatin基因可使

4、H22細(xì)胞的致瘤能力下降.轉(zhuǎn)EM13組小鼠與未轉(zhuǎn)染組小鼠的瘤體重量和血管密度無(wú)明顯差別,說明轉(zhuǎn)EM13基因?qū)22細(xì)胞的致瘤能力可能沒有影響.該研究成功的克隆了小鼠內(nèi)皮抑素EM13基因,構(gòu)建了表達(dá)載體pEGFP-N<,2>-EM13、pEGFP-N<,2>-Endostatin,并將質(zhì)粒導(dǎo)入H22細(xì)胞中,進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn).結(jié)果提示:內(nèi)皮抑素突變體EM13可能由于C末端重要的氨基酸被去除而失去了部分抑瘤功能,C末端部分氨基酸可能對(duì)其活性的發(fā)揮