缺血后處理和缺血預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護作用的對比研究.pdf

1、目的：通過動物實驗，觀察缺血后處理（ischemic postconditioning，Ⅰ-post）與缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IP）兩種方法對肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷是否產(chǎn)生保護作用，對比兩種方法的優(yōu)缺點，探討缺血后處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，為臨床上減輕肝臟缺血再灌注損傷提供更加有效的措施。
　　 方法：32只wistar大鼠，體重25

2、0g-300g，隨機分為4組，每組8只，即假手術(shù)組（sham operation，SO）、缺血再灌注組（IR）、缺血預(yù)處理組（IP）、缺血后處理組（Ⅰ-post）。（1）SO組：麻醉后開腹，僅游離肝周韌帶；（2）IR組：麻醉后游離肝周韌帶，夾閉供應(yīng)肝左葉，肝中葉和尾狀葉的血管，造成70％的肝臟缺血，但不阻斷供應(yīng)肝右葉的血管，防止門靜脈和胃腸道淤血，缺血60分鐘，再灌注120分鐘；（3）IP組：處理方法同前，缺血5分鐘，再灌注5分鐘，然后

3、缺血60分鐘，再灌注120分鐘；（4）Ⅰ-post組：處理方法同前，缺血60分鐘，再灌注2分鐘，缺血2分鐘，再灌注3分鐘，缺血2分鐘，再灌注5分鐘，缺血2分鐘，再灌注7分鐘，缺血2分鐘，恢復(fù)灌注95分鐘。各組大鼠處理完后，經(jīng)心臟采血檢測血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平。開腹取約1mm×1mm×3mm肝組織放入4％戊二醛中，待做透射電鏡檢查。另取肝組織用4％中性多聚甲醛及時固定，待做石蠟切片后行組織學(xué)檢查

4、。取肝組織約1g左右，制成10％的肝組織勻漿，于-70℃的冰箱中保存。比較各組肝組織HE染色切片；免疫組化法檢測NF-κBp65表達水平并計算陽性細胞指數(shù)（positive index，PI）；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated d-UTP nick end labeling，TUNNEL）檢測凋亡細胞并計算凋亡指數(shù)（apoptosis

5、index，AI）。用比色法檢測肝組織中SOD的活性。多組間均數(shù)差異性比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用SNK-q檢驗。全部數(shù)據(jù)利用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）SO組大鼠肝臟表面色澤光亮紅潤；IR組、IP組、Ⅰ-post組在阻斷肝血流后，肝臟顏色變成暗紅色，質(zhì)地變軟。再灌注2h后，IR組肝臟膈面顏色較前變淺，臟面的顏色可見多處暗紅色斑塊；IP組與Ⅰ-

6、post組較IR組明顯減輕。（2）HE染色結(jié)果顯示：SO組光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓清晰，肝細胞索完整，肝實質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)正常、無水腫，肝血竇無明顯淤血，中性粒細胞散在，以匯管區(qū)為甚；IR組肝小葉中央靜脈和肝血竇淤血明顯，肝血竇狹窄，肝細胞可見不同程度的濁腫變性和空泡狀變性，偶可見點狀壞死，肝組織中有中性粒細胞的聚集、浸潤，以中央靜脈周圍為甚；IP組和Ⅰ-post組肝臟淤血較IR組減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，細胞變性不明顯，中性粒細胞浸潤減輕。（3

7、）電鏡結(jié)果：IR組在×4k鏡下可見大部分雙層核膜融合，模糊不清，部分核周隙缺失，細胞周圍有一處橢圓形水腫塊；在×20k鏡下可見肝細胞線粒體絕大部分嵴，大部分膜模糊不清或融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，脫顆粒明顯。IP組在×4k鏡下可見肝細胞內(nèi)一橢圓形、電子密度較高脂滴，大部分雙層核膜融合，模糊不清，部分核周隙缺失或消失，在×20k鏡下可見肝細胞線粒體部分或大部分嵴、部分膜融合、模糊不清或缺失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象。Ⅰ-post組在×5k鏡下

8、可見肝細胞內(nèi)一橢圓形、電子密度較高脂滴，大部分雙層核膜融合，模糊不清，部分核周隙缺失或消失，細胞核有3-4個核仁，在×20k鏡下可見肝細胞線粒體部分或大部分嵴、部分膜融合、模糊不清或缺失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有脫顆?，F(xiàn)象。（4）SO組、IR組、IP組和Ⅰ-post組的血清ALT水平分別為62.67±17.88U/L、1312.83±96.95 U/L、730.67±198.80 U/L、753.67±105.73 U/L；血清AST水平分別為13

9、0.17±52.24U/L、1013.83±210.51U/L、643.17±133.77U/L、725.33±237.70U/L。IR組、IP組和Ⅰ-post組的血清ALT、AST水平較SO組明顯升高（P<0.05）；其中IR組升高最明顯，與IP組和Ⅰ-post組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；IP組和Ⅰ-post組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（5）SO組、IR組、IP組和Ⅰ-post組的NF-κB的PI分別為6.

10、83±2.27％、55.65±5.77％、35.17±6.17％、33.88±5.54％。IR組、IP組和Ⅰ-post組的肝組織中NF-κB的PI值較SO組升高（P<0.05）；其中IR組與IP組和Ⅰ-post組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；IP組和Ⅰ-post組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（6）SO組、IR組、IP組和Ⅰ-post組的AI（％）分別為1.00±1.26、10.02±4.23、5.03±1.06、6

11、.82±1.94。凋亡在SO組罕見，IR組、IP組和Ⅰ-post組都增加。IR組、IP組和Ⅰ-post組AI與SO組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中IR組與IP組和Ⅰ-post組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；IP組和Ⅰ-post組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（7）SO組、IR組、IP組和Ⅰ-post組的SOD的活性分別為14.56±2.44NU/mg、8.53±1.28NU/mg、10.64±2.35

12、 NU/mg、9.62±2.86NU/mg。IR組、IP組和Ⅰ-post組的肝組織中SOD的活性較SO組升高（P<0.05）；其中IR組與IP組和Ⅰ-post組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；IP組和Ⅰ-post組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：（1）缺血后處理可以有效減少的NF-κB表達，增加SOD的活性，降低肝細胞的凋亡，進而減輕肝臟缺血再灌注損傷。（2）缺血預(yù)處理可以有效減少的NF-κB表達，