FK506對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用及其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為特征性的血一視網(wǎng)膜屏障(Blood-retina Barrier,BRB)功能破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、黃斑水腫等一系列病變。關(guān)于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的確切機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為其為多因素綜合作用的結(jié)果，包括如糖代謝異常、白細(xì)胞黏附性的增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等，共同參與增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的病程發(fā)展。近年研究發(fā)現(xiàn)星形膠

2、質(zhì)細(xì)胞及Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)細(xì)胞之間有著廣泛且緊密的聯(lián)系。 FK506最初是作為一種強(qiáng)效免疫抑制劑在臨床開發(fā)應(yīng)用。FK506通過(guò)與淋巴細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)受體(FK506 Binding Protein，F(xiàn)KBP)結(jié)合，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。最近發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP家族不僅存在于淋巴組織中，而且存在于非淋巴組織中，如心臟、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)、新生內(nèi)膜、表皮等，具有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、通道活性調(diào)節(jié)等多種生理功能。2000年Freeman等應(yīng)用

3、RT-PCR及wetem-blot等方法首次證實(shí)了在大鼠視網(wǎng)膜中存在FKBP-12的表達(dá)，并用免疫組化法確定了其在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層中的表達(dá)，該作者還發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷的治療過(guò)程中，F(xiàn)K506可能通過(guò)抗凋亡發(fā)揮對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，為FK506在各種視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 本課題從以下4個(gè)部分進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下： 第一部分人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)的分離、培養(yǎng)、鑒定以及緊密連接蛋白在HRCECs的表達(dá)、

4、分布及形態(tài) 目的 建立一種有效可行的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)培養(yǎng)方法，并探討體外培養(yǎng)的HRCECs的生物學(xué)特性，包括生長(zhǎng)曲線及緊密連接蛋白的表達(dá)，為視網(wǎng)膜血管性疾病的研究提供良好的材料。 方法 取新鮮尸體眼球，分離剪碎視網(wǎng)膜神經(jīng)層，經(jīng)胰酶及Ⅰ型膠原酶消化后，應(yīng)用添加胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物(ITS)、β-人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(β-ECGF)及10％胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；用第VIII因子

5、相關(guān)抗原抗體免疫組化鑒定所獲得的細(xì)胞；應(yīng)用MTT檢測(cè)其生長(zhǎng)過(guò)程并繪制生長(zhǎng)曲線；用緊密連接蛋白Occludin及ZO-l免疫組化法觀察不同融合狀態(tài)HRCECs的的表達(dá)、分布及形態(tài)。 結(jié)果Ⅰ1 應(yīng)用ITS和β-ECGF的人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液成功地分離、培養(yǎng)了純度較 高的HRCECs。 2 體外培養(yǎng)的HRCECs可表達(dá)Occludin及ZO-l等緊密連接蛋白。 3 在未融合或過(guò)度融合的細(xì)胞中，緊密連接蛋白表達(dá)于

6、細(xì)胞胞漿內(nèi)；部分融合 區(qū)域可見緊密連接蛋白呈線狀分布于相鄰的細(xì)胞邊緣。 第二部分緊密連接蛋白及膠質(zhì)細(xì)胞在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的動(dòng)態(tài)變化 目的 觀察在糖尿病視網(wǎng)膜病變過(guò)程中視網(wǎng)膜血管緊密連接蛋白Occludin的時(shí)空表達(dá)改變、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活性改變以及神經(jīng)元凋亡的發(fā)展過(guò)程，探討在糖尿病病變過(guò)程中視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞、血．視網(wǎng)膜屏障及神經(jīng)細(xì)胞凋亡之間的時(shí)程關(guān)系。 方法 l血一視網(wǎng)膜屏障功能的形態(tài)學(xué)觀察：

7、 成年雄性Wistar大鼠，STz腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，分別取成模后1、3、6個(gè)月大鼠行伊凡思藍(lán)(EB)靜脈注射，2小時(shí)后摘出眼球，固定后取視網(wǎng)膜制備全視網(wǎng)膜平鋪片，用激發(fā)光為546nm波長(zhǎng)的濾光片在熒光顯微鏡下觀察染料的位置并攝片。 2視網(wǎng)膜鋪片Occludin表達(dá)時(shí)空動(dòng)態(tài)變化 成年雄性Wistar大鼠，STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，分別取成模后1、3、6個(gè)月大鼠行心臟灌注去除血管中血液成分，摘出眼球，固定后取視網(wǎng)膜制備全

8、視網(wǎng)膜鋪片，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Occlhdin的表達(dá)及形態(tài)改變，用激光共焦掃描顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)為488nm激光)觀察并攝片，并應(yīng)用Z-stacks功能重建同一血管節(jié)段緊密連接的立體結(jié)構(gòu)。 3神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性標(biāo)記蛋白——GFAP的時(shí)空表達(dá)變化 分別取成模后1、3、6個(gè)月大鼠眼球固定、石蠟包埋、切片后，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)GFAP的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，熒光顯微鏡觀察。取成模后1、3、6個(gè)月大鼠行心臟灌注去除血管

9、中血液成分，摘出眼球，固定后取視網(wǎng)膜制備全視網(wǎng)膜鋪片，應(yīng)用雙標(biāo)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ZO一1／GFAP的表達(dá)及形態(tài)改變，利用ZO一1標(biāo)記視網(wǎng)膜血管，顯示膠質(zhì)細(xì)胞與血管之間的關(guān)系。用激光共焦掃描顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)為488nm激光)觀察并攝片。 4 TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 取成模后2周、1月、3月、6月的糖尿病大鼠眼球固定、石蠟包埋、切片。應(yīng)用核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口翻譯法(terminal transferas

10、e dUTP nick endlabeling，TUNEL)檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 1血-視網(wǎng)膜屏障功能改變 EB注射后，視網(wǎng)膜平鋪片在熒光顯微鏡下可清晰地觀察到視網(wǎng)膜各級(jí)血管 的形態(tài)。正常狀態(tài)下視網(wǎng)膜血管管壁清晰，染料在血管內(nèi)沒(méi)有外漏。糖尿病1個(gè)月的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)的熒光染料未見明顯滲漏增加，僅見背景熒光增強(qiáng)；糖 尿病3個(gè)月后出現(xiàn)局部的滲漏，以毛細(xì)血管的滲漏增強(qiáng)為主；糖尿病6個(gè)月出現(xiàn)廣泛的熒

11、光染料滲漏，血管壁模糊。 2視網(wǎng)膜鋪片Occludin表達(dá)動(dòng)態(tài)變化 正常大鼠Occludin表達(dá)于視網(wǎng)膜各級(jí)血管中，形態(tài)各異。在毛細(xì)血管呈雙線或單線狀，以雙線為主；動(dòng)脈中呈網(wǎng)狀規(guī)則排列。糖尿病起病后1個(gè)月大鼠血管Occludin雖未見熒光強(qiáng)度減弱但可見形態(tài)的改變，排列紊亂，局部出現(xiàn)點(diǎn)狀熒光增多。Occludin的表達(dá)在3個(gè)月時(shí)明顯下降，動(dòng)脈及毛細(xì)血管中可見熒光網(wǎng)線的中斷，毛細(xì)血管以單線為主。6個(gè)月時(shí)，可見視網(wǎng)膜毛

12、細(xì)血管中以單線狀表達(dá)為主伴中斷，動(dòng)脈中可見網(wǎng)格稀疏，排列異常彎曲。 3凋亡在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的動(dòng)態(tài)發(fā)展 正常大鼠視網(wǎng)膜各核中未見染色陽(yáng)性，成模后2周大鼠節(jié)細(xì)胞層即可見少量凋亡細(xì)胞；成模后1個(gè)月節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層均可見少量染色陽(yáng)性細(xì)胞；成模3個(gè)月后凋亡細(xì)胞明顯增多，主要位于節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層，外核層出現(xiàn)少量棕色陽(yáng)性細(xì)胞；成模后6個(gè)月，視網(wǎng)膜各核層均可見較多的胞核棕色染色。 4視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化

13、 4.1正常大鼠視網(wǎng)膜僅神經(jīng)纖維層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層見GFAP陽(yáng)性紅色熒光染色；成模1月后糖尿病鼠神經(jīng)纖維層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)GFAP表達(dá)增多；成模3月后不僅在神經(jīng)纖維層及節(jié)細(xì)胞層中熒光強(qiáng)度增加，還可見絲狀熒光貫穿內(nèi)外核層；6個(gè)月后此改變更為明顯。 第三部分：FK506對(duì)HRCECs增殖狀態(tài)的影響 目的 觀察FK506對(duì)常規(guī)、高糖及缺氧培養(yǎng)條件下的HRCECs的增殖狀態(tài)、細(xì)胞周期的影響。 方法 1高

14、糖、缺氧培養(yǎng)條件下HRCECs生長(zhǎng)狀態(tài) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好P3-P4代HRCECs，接種于96孔板，進(jìn)行高糖(30mmol／l葡萄糖)或缺氧(125μmol／l氯化鈷誘導(dǎo))培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)1、3、5、7天細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。 2 FK506對(duì)各種培養(yǎng)條件下HRCECs的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好P3-P4代HRCECs，接種于96孔板，按下表加入混合的干預(yù)培養(yǎng)液，分別于干預(yù)后24、48、72小時(shí)進(jìn)行MTT檢測(cè)。

15、 結(jié)果 高糖培養(yǎng)抑制HRCECs的增殖，氯化鈷誘導(dǎo)的體外缺氧模型可促進(jìn)HRCECs增殖。 2 100pM的FK506對(duì)常規(guī)、缺氧及高糖培養(yǎng)的HRCECs的增殖均有顯著的抑制作用，抑制作用于干預(yù)后24～48小時(shí)出現(xiàn)。 3 FK506影響高糖培養(yǎng)狀態(tài)下的HRCECs的細(xì)胞周期，使G<,0>／G<,1>期的細(xì)胞比例增加，S期+G<,2>期的細(xì)胞比例減少。 4 FK506不影響常規(guī)培養(yǎng)及缺氧狀態(tài)下的細(xì)

16、胞周期，對(duì)各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例無(wú)改變。 5 FK506可對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs凋亡有抑制作用。 6 FK506可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制缺氧所致的HRCECs過(guò)度增殖。 第四部分 Fk506對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用 目的 探討FK506對(duì)糖尿病早期血一視網(wǎng)膜屏障破壞及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是否具有保護(hù)作用。 方法 成年雄性Wistar大鼠，STz腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，取成模后

17、14天大鼠選其中一眼玻璃體腔注射FK506 2.5ng，另一眼注射等量的稀釋10000倍80％乙醇(藥物溶劑)。手術(shù)后48小時(shí)取材進(jìn)行以下檢測(cè)：應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜鋪片Occludin的表達(dá)改變，評(píng)價(jià)血．視網(wǎng)膜屏障的改變(方法同第二部分)；取眼球行冰凍切片，每一載玻片中收三片冰凍切片，每切片相隔300μm，TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況，對(duì)每一切片陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果