G蛋白偶聯(lián)受體激酶5在斑馬魚造血系統(tǒng)發(fā)育中調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是細(xì)胞膜表面最大的一類受體超家族,具有七次跨膜螺旋結(jié)構(gòu),介導(dǎo)多種多樣的配體信號(hào),包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素、氣味以及其他小分子等,廣泛的參與多種生理功能,同時(shí)其自身也受到精細(xì)的調(diào)節(jié),其中重要的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)即為由G蛋白偶聯(lián)受體激酶(Gprotein coupled receptor kinase,GRK)介導(dǎo)的受體脫敏。目前已發(fā)現(xiàn)七種GRK亞型:GRK1-7。其分布、作用底物也不盡相同。
　　造血系統(tǒng)的發(fā)育維持受

2、到一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,GATA家族是其中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,GATA2主要分布在造血干細(xì)胞和前體細(xì)胞中,對(duì)造血系統(tǒng)的發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室以及最新的的研究報(bào)道提示,斑馬魚GRK2/3可通過與PTCH1的相互作用以及磷酸化Smo等途徑在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。本研究在以前工作的基礎(chǔ)上,以斑馬魚為模型初步探索了G蛋白偶聯(lián)受體激酶5對(duì)造血系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　本研究結(jié)果:
　　(1)我們根據(jù)斑馬

3、魚基因庫(kù)中GRK5的同源序列,通過采用提取斑馬魚總RNA,進(jìn)行RACE-PCR的方法克隆出了斑馬魚的GRK5,并對(duì)其序列進(jìn)行了進(jìn)化分析。
　　(2)采取整體原位雜交的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)GRK5在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)分布情況進(jìn)行了初步探討。采用morpholino的方法在斑馬魚中對(duì)GRK5進(jìn)行Knockdown之后,造血系統(tǒng)發(fā)育必需的標(biāo)記基因Fli-1以及Gata1的表達(dá)量均有明顯下降,這種現(xiàn)象能被外轉(zhuǎn)的GRK5全長(zhǎng)蛋白以及激酶活性缺失突變體K

4、215R所逆轉(zhuǎn)。提示GRK5可能參與到造血系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)控。
　　(3)通過免疫共沉淀的方法,我們發(fā)現(xiàn)GRK5與GATA2存在相互作用,并且GRK5的216位精氨酸在與GATA2發(fā)生相互作用中是必需的。
　　(4)在過表達(dá)GRK5或者對(duì)GRK5進(jìn)行Knockdown之后采用RT-PCR的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證造血相關(guān)GATA2下游基因包括α-globin、γ-globin、MLF1、P27、PU1的表達(dá)均發(fā)生明顯改變。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GR

5、K5與GATA2相互作用功能缺失突變體GRK5-R216L不能逆轉(zhuǎn)由GRK5的Knockdown引起的斑馬魚造血系統(tǒng)發(fā)育必需的標(biāo)記基因的表達(dá)異常。
　　綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)：
　　(1)GRK5對(duì)斑馬魚造血正常發(fā)育必需的標(biāo)記基因Fli-1和Gata-1的正常表達(dá)是必需的,提示其可能參與到斑馬魚造血系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控;
　　(2)GRK5通過與GATA2的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)GATA2的轉(zhuǎn)錄活性并影響GATA2下游基因表達(dá),這為進(jìn)