氧化應(yīng)激損傷在H1N1型流感病毒致宿主細(xì)胞凋亡中的研究.pdf

1、流行性感冒是嚴(yán)重影響人類健康的最常見的原因之一。進(jìn)入21世紀(jì)以來，2006年的H5N1型禽流感、今年爆發(fā)流行的H1N1型流感，都給人類的工作和生活帶來嚴(yán)重影響。正因如此，流感病毒致病機(jī)理的研究一直都是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，為廣大學(xué)者所接受的致病機(jī)理中，流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷機(jī)制都是重要的學(xué)說，但關(guān)于兩種機(jī)制之間關(guān)系的研究國內(nèi)外未見報(bào)道。其它領(lǐng)域的研究證明，氧化應(yīng)激可通過多條途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Xu JJ等人通過對培養(yǎng)的心

2、肌細(xì)胞研究，證明了氧化應(yīng)激與凋亡之間的關(guān)系[1]；研究還發(fā)現(xiàn)在非肥胖糖尿病鼠胰島中存在過度氧化所致的凋亡現(xiàn)象[2]。在立足國內(nèi)外研究進(jìn)展和流感病毒致病機(jī)制的基礎(chǔ)上，本研究將從新的視角探討流感病毒所致的細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激損傷之間的關(guān)系。
　　 目的：
　　 本課題旨在證明研究氧化應(yīng)激損傷在流感病毒感染并最終致宿主細(xì)胞凋亡的過程中的存在；流感病毒感染宿主細(xì)胞可導(dǎo)致脂質(zhì)氧化損傷和DNA、RNA堿基氧化損傷。同時(shí)，通過對宿主細(xì)胞

3、氧化損傷程度與流感病毒致宿主細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系研究，揭示流感病毒致宿主細(xì)胞的氧化損傷在宿主細(xì)胞凋亡中的作用。加強(qiáng)對流感病毒致宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制的認(rèn)識，為該病毒致病機(jī)理研究提供了新的思路，為抗流感藥物的開發(fā)提供新的靶點(diǎn)，也為高致病性人禽流感的預(yù)防、防控提供了新的視角和依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分：流感病毒實(shí)驗(yàn)用毒劑量確定
　　 雞胚尿囊腔接種H1N1型流感病毒，經(jīng)病毒復(fù)制、擴(kuò)增、收獲病毒，通過檢測MDCK

4、細(xì)胞的半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量（TCID50），確定該毒株實(shí)驗(yàn)用毒劑量，并經(jīng)預(yù)試驗(yàn)給予驗(yàn)證。
　　 第二部分：流感病毒感染MDCK細(xì)胞后的凋亡率檢測
　　 利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測病毒感染MDCK細(xì)胞1h后繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率。
　　 第三部分：流感病毒感染MDCK細(xì)胞后MDA的含量檢測
　　 利用MDA檢測試劑盒檢測病毒感染MDCK細(xì)

5、胞1h后繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)的MDA含量。
　　 第四部分：流感病毒感染MDCK細(xì)胞后8-oxo-G表達(dá)情況檢測
　　 細(xì)胞爬片經(jīng)過不同的預(yù)處理，利用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測病毒感染MDCK細(xì)胞1h后繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)的DNA中的8-oxo-G和RNA中8-oxo-G表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.該毒株感染MDC

6、K細(xì)胞的TCID50為10-4.5/0.1ml，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定毒株的實(shí)驗(yàn)用毒劑量為100 TCID50。
　　 2.該毒株的實(shí)驗(yàn)用毒劑量能感染并誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞的凋亡，且凋亡率隨著檢測時(shí)間延長呈上升趨勢，前6h凋亡率與對照組無明顯差異（P>0.05），12h凋亡率開始上升達(dá)6.422％±0.326（P＜0.01），24h、48h分別為9.570％±0.229、9.178％±0.286，與對照組有明顯差異（P＜0.01）。

7、>　　 3.病毒感染細(xì)胞后，MDA含量隨著檢測時(shí)間的延長而下降，0h MDA水平達(dá)高峰1.490±0.053nmol/mgprot（P＜0.01），1-6h維持在較高水平，依次為1.221±0.036 nmol/mgprot，1.157±0.061 nmol/mgprot，1.089±0.038 nmol/mgprot（P＜0.01），12h后MDA水平明顯下降至0.636±0.033 nmol/mgprot （P＜0.01），24h

8、、48h MDA水平與對照組比較無顯著性差別（P>0.05）。
　　 4.該毒株感染MDCK細(xì)胞后，能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞DNA和RNA中8-oxo-G的表達(dá)。DNA中8-oxo-G表達(dá)情況如下：含8-oxo-G的陽性細(xì)胞百分比隨著時(shí)間呈明顯上升趨勢（P＜0.05）。0h陽性細(xì)胞百分比已達(dá)12.20±3.16（P＜0.05），之后的1h、3h、6h、12h、24h陽性細(xì)胞百分比逐漸上升,各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞百分比與對照組差異明顯（P＜0.0

9、1），48h陽性細(xì)胞百分比達(dá)到最高87.45±3.98（P＜0.01）。RNA中8-oxo-G表達(dá)情況如下：該毒株感染細(xì)胞之后，RNA中8-oxo-G表達(dá)情況隨時(shí)間呈明顯上升趨勢（P＜0.05），各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組8-oxo-G陽性細(xì)胞表達(dá)情況依次為9.93±1.45；12.38±1.92；26.70±0.86；46.55±2.92；58.89±2.02；72.72±2.13；80.63±0.97（P＜0.01）。同時(shí)，細(xì)胞DNA中8-ox

10、o-G陽性百分比在1h、3h、6h、12h明顯高于同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞RNA中。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：H1N1型流感病毒能明顯誘導(dǎo)宿主MDCK細(xì)胞凋亡，凋亡率隨著檢測時(shí)間延長升高；H1N1型流感病毒感染宿主MDCK細(xì)胞過程中存在脂質(zhì)氧化損傷，丙二醛濃度隨檢測時(shí)間推移呈下降趨勢，且凋亡率和MDA含量有高度三次方線性關(guān)系，關(guān)系方程為Y=23.09－42.17X+29.82X2－7.16X3，曲線的決定系數(shù)R2為0.998