人腦星形細(xì)胞腫瘤VEGF分布與微血管構(gòu)筑關(guān)系的定量病理學(xué)研究.pdf

1、星形細(xì)胞腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的膠質(zhì)瘤類型，其血管生成活躍。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial.growthfactor,VEGF)是血管生成中起主要作用并研究的最為深入的血管生成因子之一，它與其受體結(jié)合后促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化、血管重塑而致血管生成。腫瘤內(nèi)VEGF表達(dá)以及微血管密度(microvesseldensity,MVD)的測定可作為判斷腦星形細(xì)胞瘤惡性潛能的重要生物學(xué)指標(biāo)和病理診斷、預(yù)后判斷指標(biāo)

2、，檢測VEGF的表達(dá)狀態(tài)對進一步認(rèn)識腫瘤血管形成的機制有重要作用。腫瘤問質(zhì)中新生微血管的密度、形態(tài)、結(jié)構(gòu)(組成)及其隨腫瘤演進在瘤組織內(nèi)的三維分布可統(tǒng)稱為“腫瘤微血管構(gòu)筑表型”(tumormicrovasculararchitecturephenotype，T-MAP)。研究發(fā)現(xiàn)在癌前病變與癌之間、原發(fā)瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間T-MAP存在差異；另一方面，抗癌藥治療的過程對微血管構(gòu)筑也有明顯影響，提示T-MAP在腫瘤學(xué)上有重要意義。T-MAP的多

3、樣性和差異性統(tǒng)稱為T-MAP異質(zhì)性(T-MAPheterogeneity，T-MAPH)。組織芯片(tissuechips)，或稱組織微陣列(tissuemicroarray)，是將數(shù)十個甚至上千個不同病人的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列。組織芯片為醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)提供一種高量、大樣本以及快速的分子水平分析工具。它克服了傳統(tǒng)病理學(xué)制樣方法中存在的操作復(fù)雜、自動化程度低、檢測效率低等缺陷，可有效利用成百上千份自然或處于疾病狀

4、態(tài)下的組織標(biāo)本來研究特定基因及其所表達(dá)的蛋白質(zhì)與疾病之間的相關(guān)關(guān)系。組織芯片技術(shù)以其高通量的特性使得科研人員能同時對大量標(biāo)本的基因、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平進行研究并能進行很好的質(zhì)控，從而提高研究結(jié)果的可靠性。因此，利用免疫組織化學(xué)雙染技術(shù)在組織芯片上定量分析微血管構(gòu)筑參數(shù)以及VEGF表達(dá)情況，能對膠質(zhì)瘤的診斷、療效評估等提供客觀的依據(jù)，為腫瘤的抗血管生成治療的新思路、新策略提供理論基礎(chǔ)。圖像分析技術(shù)可以間接地反映腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變

5、，成為一項非常便捷的分析檢測技術(shù)。 腫瘤血管生成中，T-MAPH還包括血管構(gòu)成的三維形態(tài)，在普通光學(xué)顯微鏡下，很難觀察到微血管構(gòu)筑的三維形態(tài)，而在計算機輔助三維重建技術(shù)產(chǎn)生并實用化后，利用組織連續(xù)切片對腫瘤不同發(fā)展階段腫瘤組織中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分布情況進行三維重建，并對T-MAPH的三維形態(tài)進行觀察和測量，從而從空間構(gòu)型上實現(xiàn)顯示組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在深入探討細(xì)胞因子與血管生成以及臨床預(yù)后、療效評估等各方面中有著重要的意義。

6、 本研究以在本科室前期完成的含有不同級別和不同微血管形態(tài)的星形細(xì)胞腫瘤組織組織芯片的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫雙標(biāo)技術(shù)和圖像分析方法對微血管數(shù)目、微血管平均周長和VEGF陽性單位(positiveunit,PU)值進行定量分析，且應(yīng)用三維重建技術(shù)對總厚度為320μm的腫瘤組織連續(xù)切片中CD34陽性內(nèi)皮細(xì)胞的空間分布進行重建，并對所獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和應(yīng)用數(shù)學(xué)軟件進行分析。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 一、對人腦星形細(xì)胞腫瘤組織芯片進行

7、CD34/VEGF免疫組織化學(xué)雙標(biāo)和圖像分析及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)VEGFPU值、微血管密度隨腫瘤的級別升高而增大，而腫瘤中微血管的平均周長隨之減小 在本科室前期完成的168點陣組織芯片(80例人腦星形細(xì)胞腫瘤，其中彌漫性星形細(xì)胞瘤31例，問變性星形細(xì)胞瘤32例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤17例；所制芯片點陣排列為薄壁血管WHOII級43點、WHOⅢ級38點、WHOⅣ級23點；厚壁血管WHOⅢ級24點、WHOⅣ級16點；腎小球樣血管wHOⅣ級11點；

8、血管心假菊形團樣結(jié)構(gòu)血管WHOII級1點、WHOⅢ級2點、WHOⅣ2點)上進行CD34和VEGF雙標(biāo)記，并在此基礎(chǔ)上利用圖像分析軟件ImageProPlus5.1中文版對微血管構(gòu)筑參數(shù)和VEGF的表達(dá)進行定量分析，結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中VEGFPU值和微血管密度隨著腫瘤級別的增高而增大，各級別之間有顯著性差異；血管平均周長隨著腫瘤級別的增高而減小，問變性星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤無顯著差異，兩者分別與彌漫性星形細(xì)胞瘤之間有顯著差異，這與既

9、往定性分析結(jié)果吻合[1,18-22]。結(jié)果說明，微血管密度、血管平均周長能作為微血管構(gòu)筑參數(shù)應(yīng)用；在膠質(zhì)瘤血管生成和級別判定中可客觀的運用VEGFPU值。 二、星形細(xì)胞腫瘤中VEGF的表達(dá)量和分布存在不同的模式，它不僅促進了血管生成，而且與微血管分布之間存在數(shù)學(xué)模型關(guān)系。 采用免疫組織化學(xué)雙重染色技術(shù)分別標(biāo)記星形細(xì)胞瘤組織芯片中(CD34和VEGF，采集染色結(jié)果，選擇不同級別的單個點陣，并隨機選取其中圓度為1.000～1

10、.350的微血管，利用圖像分析軟件對血管周圍各點的VEGF進行光密度測定以及點坐標(biāo)定位，通過計算和分析，建立VEGF濃度梯度與離壁距離的數(shù)學(xué)方程式。結(jié)果表明：VEGF在瘤組織內(nèi)的分布與新生微血管的分布和形態(tài)有密切關(guān)系，選定范圍內(nèi)(離壁距離0～8μm)測定點的VEGF光密度值(濃度，y)與該點到血管壁的距離(x)的數(shù)學(xué)關(guān)系模型為：Y=1/√45.1+6.06x(相關(guān)系數(shù)R＝0.6124，P＜0.001)。在不同星形細(xì)胞腫瘤中VEGF的表達(dá)

11、量和分布存在不同的模式，這表明VEGF不僅促進了血管生成，而且與微血管分布之間有數(shù)學(xué)模型關(guān)系 三、采用三維重建技術(shù)構(gòu)建出腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的空間分布 應(yīng)用計算機三維重建軟件3DDOCTOR對人腦彌漫性星形細(xì)胞瘤連續(xù)切片中不同區(qū)域的CD34陽性細(xì)胞進行三維重建，成功構(gòu)建了星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤部分微血管內(nèi)皮的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示星形細(xì)胞腫瘤內(nèi)微血管分枝而不均一，甚至部分血管有扭曲走向，以大量新生的幼稚毛細(xì)血管為主，同時存在管腔較大的

12、微血管、微血管出芽生成的單盲端血管以及單個內(nèi)皮細(xì)胞聚集成索狀的現(xiàn)象。惡性星形細(xì)胞腫瘤的微血管不僅豐富，而且具有形態(tài)結(jié)構(gòu)的多樣性和異質(zhì)性，這一特點對于認(rèn)識惡性腫瘤血管生成三維結(jié)構(gòu)特性、構(gòu)建數(shù)字化虛擬腫瘤微血管模型及其在抗血管生成治療上可能有重要意義。 本研究的意義： 腫瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性的存在，與腫瘤細(xì)胞分泌的生長因子尤其是VEGF構(gòu)成的微環(huán)境對微血管內(nèi)皮異質(zhì)性存在著調(diào)控作用，因此研究微血管周圍VEGF的分布與微血管之