軟骨素酶ABC促進(jìn)自體神經(jīng)移植后軸突再生.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷后增殖的雪旺細(xì)胞提供了一個(gè)有利于軸突再生的環(huán)境。它可作為軸突生長(zhǎng)的細(xì)胞底物，并可以分泌眾多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，表面表達(dá)細(xì)胞粘連分子和整合蛋白，產(chǎn)生層粘蛋白、纖連蛋白、膠原和蛋白聚糖等胞外基質(zhì)分子。還分泌多種單核細(xì)胞趨化因子以刺激巨噬細(xì)胞向變性神經(jīng)的募集，后者可清除軸突和髓鞘碎片，并清除抑制軸突生長(zhǎng)的髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)。由多種胞外基質(zhì)成分構(gòu)成的基底膜是周圍神經(jīng)再生所必需的生長(zhǎng)底物。神經(jīng)損傷后，損傷以遠(yuǎn)的基底膜的完整性能得以保留

2、是神經(jīng)再生的必要條件。在眾多胞外基質(zhì)分子中既有促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的分子，如層粘蛋白、纖連蛋白和Ⅳ型膠原等，也有抑制軸突生長(zhǎng)的分子，如硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGs)。后者同樣存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，并是抑制中樞神經(jīng)損傷后再生的重要因素。周圍神經(jīng)損傷后胞外基質(zhì)的重塑，即增加促軸突生長(zhǎng)的分子，去除抑制分子，對(duì)于神經(jīng)再生是十分重要的。軟骨素酶ABC是針對(duì)葡糖胺聚糖(GAG)的特異性糖苷酶，可以分解CSPGs上的GAG側(cè)鏈，從而降解CSPGs。利用軟骨

3、素酶ABC降解CSPGs來促進(jìn)神經(jīng)再生，改善功能恢復(fù)已經(jīng)在眾多中樞神經(jīng)損傷的研究中得到證實(shí)，但有關(guān)其對(duì)周圍神經(jīng)再生的作用的研究還很少。此外軟骨素酶ABC治療對(duì)雪旺細(xì)胞的影響，以及對(duì)基底膜的其他成分和基底膜結(jié)構(gòu)完整性的影響均不明了。 本研究以大鼠為研究對(duì)象，建立自體坐骨神經(jīng)移植模型，用軟骨素酶ABC對(duì)移植的神經(jīng)進(jìn)行移植前預(yù)處理。通過電生理檢查和組織學(xué)觀察研究移植后神經(jīng)再生的情況，并利用免疫組化技術(shù)觀察軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)內(nèi)

4、雪旺細(xì)胞和基底膜層粘蛋白這兩種主要的促再生因素的影響。 方法： 1．軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)再生的影響30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。A組為空白對(duì)照組，B組為賦形劑組，C組為實(shí)驗(yàn)組(軟骨素酶治療組)。 鹽酸氯胺酮注射液腹腔注射麻醉。兩側(cè)臀部斜行切口。劈開臀肌，分離股二頭肌和半膜半腱肌，暴露并游離各組雙側(cè)坐骨神經(jīng)。在距離梨狀肌下緣約8mm處向遠(yuǎn)端切除右側(cè)坐骨神經(jīng)5mm，兩斷端回縮后形成約10mm的間隙以接納

5、移植神經(jīng)；切除左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm作為移植神經(jīng)。A組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10mm直接移植于右側(cè)缺損處。B組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm，在100μl PBS(賦形劑)溶液中浸泡2 h 后移植于右側(cè)缺損處。C組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10mm，在100μl軟骨素酶 ABC 溶液中(10U/ml)浸泡2 h后移植于右側(cè)缺損處。術(shù)后8周進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定。電生理檢查完畢后切取各組移植神經(jīng)中段5 mm的神經(jīng)節(jié)段。每組各隨機(jī)選取1個(gè)神經(jīng)節(jié)段做透射

6、電鏡觀察，其余神經(jīng)節(jié)段制成橫切片，做神經(jīng)纖維Palmgren鍍銀染色，光學(xué)顯微鏡觀察再生軸突的密度。 2．軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)層粘蛋白/基底膜的影響16只大鼠隨機(jī)分為2組，每組8只。A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組。 手術(shù)方法同上。A組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm直接移植于右側(cè)缺損處。B組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10mm，在100μl軟骨素酶ABE溶液中浸泡2h后移植于右側(cè)缺損處。 術(shù)后5天取材。切取各組移植神經(jīng)近段

7、5mm的神經(jīng)節(jié)段制成橫切片，用多克隆抗層粘蛋白抗體標(biāo)記層粘蛋白，觀察層粘蛋白免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物在移植神經(jīng)內(nèi)的分布概況。 3．軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)雪旺細(xì)胞的影響16只大鼠隨機(jī)分為2組，每組8只。A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組。 手術(shù)方法同上。A組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm直接移植于右側(cè)缺損處。B組：切取左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm，在100μl軟骨素酶ABC溶液中浸泡2 h后移植于右側(cè)缺損處。 術(shù)后14天取材。切取各

8、組移植神經(jīng)近段5 mm的神經(jīng)節(jié)段制成橫切片，用多克隆抗S-100蛋白抗體標(biāo)記雪旺細(xì)胞，觀察移植神經(jīng)內(nèi)S-100免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的密度。 結(jié)果： 1．軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)再生的影響術(shù)后8周時(shí)A、B、C三組移植神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.381)，空白對(duì)照組與賦形劑組之間再生軸突數(shù)目的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.607)，實(shí)驗(yàn)組再生軸突的數(shù)目多于空白對(duì)照組和賦形劑組(P<0.05)。 2．

9、軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)層粘蛋白/基底膜的影響術(shù)后5天時(shí)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的基底膜均呈現(xiàn)層粘蛋白陽性反應(yīng)，且兩組基底膜結(jié)構(gòu)的完整性相似。 3．軟骨素酶ABC治療對(duì)移植神經(jīng)雪旺細(xì)胞的影響術(shù)后14天時(shí)兩組大鼠移植神經(jīng)均見S-100陽性染色細(xì)胞，分布較為均勻。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組S-100陽性染色細(xì)胞的密度的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.945)。 上述結(jié)果提示： 1．軟骨素酶ABC對(duì)移植神經(jīng)做移植前預(yù)處理，可以促進(jìn)近端神經(jīng)