胸苷酸合成酶、Src酪氨酸激酶在肺腺癌中的表達(dá)及其與培美曲塞耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率占癌癥死亡率之首。其中非小細(xì)胞肺癌占70％～80％，而肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型。化療是肺腺癌主要的治療手段，培美曲塞作為新一代的化療藥物，是多靶點(diǎn)抗葉酸代謝藥物，近年來在肺腺癌的一線治療中廣泛應(yīng)用。然而在臨床工作中發(fā)現(xiàn)其療效存在明顯的個(gè)體差異，提示在不同的個(gè)體中存在影響培美曲塞敏感的相關(guān)因素。
　　隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，耐藥基因的表達(dá)是影響化療藥物敏感的關(guān)鍵。通過尋找耐藥基因并分析其與

2、化療藥物敏感性的關(guān)系來預(yù)測療效，進(jìn)而指導(dǎo)臨床選擇有效的化療藥物已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)胸苷酸合成酶(thymidylate sythase，TS)、非受體酪氨酸激酶Src的表達(dá)與培美曲塞的療效相關(guān)。肺腺癌細(xì)胞中胸苷酸合成酶的高表達(dá)將降低其對培美曲塞的敏感性。在人類正常細(xì)胞中存在的Src基因?yàn)閏-Src，作為原癌基因其編碼Src酪氨酸激酶。研究發(fā)現(xiàn)Src在上皮腫瘤組織中表達(dá)及活性均較高，并且常常與腫瘤發(fā)展階段和惡性程度相關(guān)。Sr

3、c包含SH1、SH2、SH3共3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，SH1激酶域含有正調(diào)節(jié)自主磷酸化位點(diǎn)Y416，SH2蛋白區(qū)域和SH1激酶域?yàn)榧?xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必需，SH3蛋白區(qū)域則對細(xì)胞骨架的重組和Src蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要意義。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Src在肺腺癌細(xì)胞的活性直接影響以TS為靶酶的培美曲塞的療效，但Src與TS參與培美曲塞耐藥的機(jī)制尚不明確，Src基因可能通過對TS的調(diào)控影響培美曲塞的敏感性。因此，本研究探討了Src與TS在肺腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其參

4、與培美曲塞耐藥的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下三部分。
　　第一部分、胸苷酸合成酶、Src酪氨酸激酶在肺腺癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化方法檢測肺腺癌組織TS、SrcmRNA及蛋白的表達(dá)，試圖了解肺腺癌組織TS及Src的表達(dá)情況、認(rèn)識影響培美曲塞敏感性的臨床病理特征及其規(guī)律，探討TS及Src與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:采用免疫組織化學(xué)方法檢測100例肺腺癌患者術(shù)后癌組織及相對應(yīng)的癌旁組織

5、中的TS、Src蛋白的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測TS、Src的mRNA表達(dá)，病例來自2008年1月至2013年1月唐山市三家三級甲等醫(yī)院，同時(shí)收集每個(gè)患者的臨床病理資料，并對每一位患者進(jìn)行預(yù)后隨訪;統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料中率的差異性使用x2檢驗(yàn)或校正的x2檢驗(yàn)，采用非參數(shù)Spearman等級相關(guān)分析法分析等級資料，用Kaplan-Merier法及Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型

6、的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行多因素生存分析，分析TS、Src的表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:肺腺癌組織中TS和Src蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁組織（均P＜0.05）;TS蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙密切相關(guān)，有吸煙史、組織分化程度低、臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者TS蛋白均高表達(dá)（均P＜0.05）;但年齡、性別、腫瘤大小與TS蛋白表達(dá)無關(guān)（均P＞0.05）。而Src蛋

7、白的表達(dá)僅與吸煙、腫塊大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（均P＜0.05）。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:TS、Src的mRNA與腫瘤組織分化程度相關(guān)（P＜0.05）。Kaplan-Merier法顯示TS及Src表達(dá)與無病生存期(Disease-free survival，DFS)、總生存期(Overall survival，OS)之間存在負(fù)相關(guān)(P＜0.05，r=0.23)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示:TS、Src表達(dá)均可能是影響肺腺患者預(yù)后的獨(dú)立危

8、險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論:
　　1.TS和Src在肺腺癌組織高表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞分化程度低，臨床分期晚及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);
　　2.TS和Src的表達(dá)是影響DFS及OS的重要預(yù)后影響因素之一。
　　第二部分、培美曲塞耐藥肺腺癌細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)行為
　　目的:肺腺癌細(xì)胞對于培美曲塞耐藥的機(jī)制尚不明確，本研究通過誘導(dǎo)培美曲塞耐藥的肺腺癌細(xì)胞株，觀察其生物學(xué)行為，探討培美曲塞耐藥的肺腺癌細(xì)胞株的建立方法及其生物學(xué)特性

9、，建立培美曲塞耐藥的細(xì)胞模型。
　　方法:采用間歇濃度沖擊法應(yīng)用培美曲塞誘導(dǎo)A549細(xì)胞成為耐藥細(xì)胞株A549/PEM，MTT法檢測細(xì)胞的增殖抑制率，侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測耐藥細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，繪制生長曲線并計(jì)算倍增時(shí)間，以流式細(xì)胞術(shù)檢測其周期分布情況。
　　結(jié)果:應(yīng)用MTT法測得培美曲塞對A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(Inhibitory Concentration50％，IC50)為180.75ng/ml，經(jīng)過4個(gè)月藥物

10、反復(fù)誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)出耐藥指數(shù)為27.13倍的人肺腺癌A549耐藥細(xì)胞株(A549/PEM)，為培美曲塞高倍耐藥株。A549/PEM與A549相比倍增時(shí)間無明顯差異，分別為(62.35±0.89)h和(62.78±1.06)h(P＞0.05)。A549/PEM與A549細(xì)胞相比，處于G1/G0期的細(xì)胞比例沒有變化，處于S期的細(xì)胞比例增加（P＜0.05），劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明耐藥株運(yùn)動(dòng)侵襲及遷移能力高于親本株(P＜0.05)。

11、　　結(jié)論:
　　1.間歇濃度沖擊法可誘導(dǎo)出對培美曲塞高倍耐藥的肺腺癌細(xì)胞株，A549/PEM與親本株相比，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)，更具有侵襲性;
　　2.A549/PEM與A549相比，A549/PEM細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為S期細(xì)胞數(shù)比例增加，提示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　第三部分、胸苷酸合成酶、Src酪氨酸激酶在肺腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)與培美曲塞耐藥關(guān)系的研究
　　目的:培美曲塞耐藥涉及多種機(jī)制，培美曲塞的療效與

12、其作用靶點(diǎn)酶TS的表達(dá)有關(guān)，有研究證實(shí)Src的表達(dá)與肺腺癌的進(jìn)展相關(guān)。本研究通過mRNA芯片技術(shù)和Western blot，對比A549/PEM與A549的基因差異;分析A549/PEM及A549中Src、TS的mRNA及蛋白表達(dá)的變化;通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默Src基因后，觀察A549/PEM中TS蛋白的表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的情況，探討TS、Src在肺腺癌細(xì)胞對培美曲塞繼發(fā)性耐藥機(jī)制中的作用。
　　方法:mRNA芯片分別比對A

13、549/PEM及A549的基因差異。實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測TS及Src在A549/PEM及A549中mRNA及蛋白的表達(dá)差異。轉(zhuǎn)染c-Src siRNA沉默Src基因表達(dá)后，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測A549/PEM中Src的mRNA及蛋白表達(dá)，Western blot法檢測TS蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測耐藥株的凋亡及增殖情況。
　　結(jié)果:mRNA芯片比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549/PEM及A549

14、的基因存在明顯差異，Src和TS以及編碼Src SH2的mRNA都表達(dá)上調(diào)（2倍以上增高）。TS及Src在A549/PEM及A549中mRNA及蛋白的表達(dá)差異明顯，A549/PEM呈高表達(dá)(P＜0.05）。轉(zhuǎn)染c-Src siRNA沉默Src基因表達(dá)后，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot驗(yàn)證A549/PEM中Src沉默，Western blot法檢測TS蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)Src沉默后TS表達(dá)減少，(P＜0.05）。siRNA轉(zhuǎn)染后耐