小麥近緣種谷蛋白新亞基鑒定與編碼基因克隆及其分子進(jìn)化分析.pdf

1、小麥谷蛋白是貯藏蛋白中的主要成分，由高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)兩部分組成。HMW-GS與LMW-GS的含量及組成可直接影響小麥面粉的加工和烘烤品質(zhì)。研究顯示，粗山羊草(Aegilopstauschii，DD，2n=2x=14)的Glu-1Dt位點(diǎn)編碼的HMW-GS變異類型豐富，且大多為普通小麥中尚未發(fā)現(xiàn)的新類型。栽培一粒小麥(TriticummonococcumL.，AmAm，2n=2x=14

2、)的Glu-1Am位點(diǎn)編碼的LMW-GS等位基因出現(xiàn)的變異頻率也非常高，因此從小麥近緣種中尋找新的候選優(yōu)質(zhì)谷蛋白基因?qū)π←溒焚|(zhì)改良具有重要意義。本研究以粗山羊草和栽培一粒小麥為材料，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、等電聚焦雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(IEF×SDS-PAGE)、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)、反相高效液相色譜(RP-HPLC)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等多種方法對(duì)H

3、MW-GS和LMW-GS進(jìn)行分離和鑒定，然后設(shè)計(jì)等位基因特異PCR(AS-PCR)引物對(duì)其編碼基因進(jìn)行分子克隆、序列測(cè)定與結(jié)構(gòu)比較，分析貯藏蛋白基因家族的分子進(jìn)化關(guān)系和預(yù)測(cè)谷蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，并將來(lái)自粗山羊草和硬粒小麥的HMW-GS編碼基因連接到表達(dá)載體上，使其在E.coli中高效表達(dá)，初步探討其表達(dá)特性。主要研究結(jié)果如下： 1.粗山羊草HMW谷蛋白新亞基的分離與鑒定。利用SDS-PAGE，在粗山羊草T16、T132和T128

4、中初步鑒定出了3個(gè)新的x-型HMW-GS，分別命名為1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些新的亞基組合，如1Dx1.6t+1Dy12.4t，1Dx3t+1Dy10.1t和1Dx5.2t+1Dy12t。然后采用IEF×SDS-PAGE、HPCE和RP-HPLC三種分離方法對(duì)以上新亞基和亞基組合進(jìn)一步表征和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-DE分離除1Dy12t和1Dy10.1t亞基外，其他亞基均分離出不同的多個(gè)蛋白組分，1Dx型亞基一

5、般包括2-4個(gè)蛋白點(diǎn)。同時(shí)，在HPCE圖譜中，這些亞基多表現(xiàn)為一個(gè)主峰加1-2個(gè)副峰，由此推測(cè)這些HMW-GS可能存在蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。對(duì)粗山羊草HMW-GS的RP-HPLC分析表明，1Dx亞基疏水性大于1Dy亞基，這反映了它們理化性質(zhì)的不同。MALDI-TOF-MS測(cè)得的1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t亞基的精確分子量分別為88565.8Da、86934.5Da和86651.2Da。 2.粗山羊草HMW-GS編碼基

6、因的分子克隆、序列比較和進(jìn)化分析。根據(jù)HMW-GS編碼基因5’和3’端的保守序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增1Dx型亞基的AS-PCR引物，以含有新亞基的粗山羊草T16、T132和T128的基因組DNA為模板擴(kuò)增，均獲得了約2500bp左右的單一條帶，分別回收并克隆到T-Easy載體上，DNA測(cè)序后得到1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t亞基編碼基因的全序列，分別命名為1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t?；?Dx3t和1Dx5.2t

7、已登陸GenBank，編號(hào)為DQ307383和DQ307384。 1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t的DNA序列全長(zhǎng)為2541bp、2514bp和2514bp，以ATG起始密碼子開(kāi)始，雙終止密碼子TGATAG結(jié)束，分別編碼845個(gè)、836個(gè)和836個(gè)氨基酸殘基。推導(dǎo)的氨基酸序列具有典型的HMW-GS的序列結(jié)構(gòu)特征，由21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、89個(gè)氨基酸的N-端(3個(gè)Cys)、三肽，六肽和九肽構(gòu)成的中央重復(fù)區(qū)和42個(gè)氨基酸的

8、C-端(1個(gè)Cys)四個(gè)部分組成。氨基酸序列比較顯示：1Dx5.2t與優(yōu)質(zhì)亞基1Dx5的相似性較高，都含有5個(gè)Cys，1Dx5.2t亞基的額外Cys位于重復(fù)區(qū)第278位，此外預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β轉(zhuǎn)角的含量均較高，因此該基因很有可能是優(yōu)質(zhì)候選基因。1Dx1.6t和1Dx3t亞基氨基酸序列推導(dǎo)的成熟蛋白的分子量，均比質(zhì)譜測(cè)得的種子中亞基的精確分子量小，其差異在270.3-787.5Da之間，進(jìn)一步表明這些x-型HMW-GS亞基可能存在翻譯后修

9、飾，如糖基化或磷酸化等。另外，三個(gè)亞基基因序列中存在著豐富的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，共檢測(cè)到29個(gè)SNPs，其中有義突變?yōu)?3％，多數(shù)為谷氨酰胺/甘氨酸→精氨酸突變。進(jìn)化分析表明：來(lái)自粗山羊草的x-型亞基與普通小麥中的1Dx亞基同源性很高，基因和氨基酸序列的相似性達(dá)到97％-99％。 3.克隆基因的原核表達(dá)。設(shè)計(jì)兩對(duì)不含有信號(hào)肽的表達(dá)引物，分別擴(kuò)增硬粒小麥Simeto中的y-型亞基基因1By8和粗山羊草的1Dy12.2t(已

10、由本實(shí)驗(yàn)室克隆)及x-型亞基基因1Dx1.6t、1Dx3t和1Dx5.2t，擴(kuò)增片斷克隆到表達(dá)載體pET28a或pET30a上，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL-21(DE3)plysS與Rosetta(DE3)plysS。IPTG誘導(dǎo)后，以上五個(gè)HMW-GS編碼基因均在E.coli中獲得了高效表達(dá)。SDS-PAGE分析表明，體外表達(dá)的蛋白與種子中的HMW-GS遷移率基本相同。Western檢測(cè)顯示，E.coli中表達(dá)的蛋白和種子蛋白均與HMW-GS多

11、克隆抗體出現(xiàn)較強(qiáng)的雜交信號(hào)。這些體外表達(dá)的蛋白純化后，可進(jìn)行亞基功能的進(jìn)一步鑒定。 4.栽培一粒小麥LMW-GS編碼基因的鑒定、分子克隆與進(jìn)化分析。通過(guò)SDS-PAGE，在栽培一粒小麥Mo-M1、Mo-M3和Mo-M5中鑒定出三個(gè)新的LMW-GS，命名為L(zhǎng)MW-M1、LMW-M3和LMW-M5。利用MALDI-TOF-MS獲得了它們的精確分子量。以一對(duì)LMW-GS的AS-PCR引物對(duì)編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后得到完全DNA序列，包

12、括上游、開(kāi)放閱讀框和下游，均無(wú)內(nèi)含子。根據(jù)推導(dǎo)出的氨基酸序列，三個(gè)基因即LMW-M1、LMW-M3、LMW-M5均編碼LMW-i型亞基，分子量在38520.6Da-38720.8Da之間，小于質(zhì)譜測(cè)定的分子量。三個(gè)基因已登錄GeneBank，編號(hào)為DQ307388，DQ307389和DQ345449。氨基酸序列比較顯示，它們與普通小麥中已克隆的LMW-i型基因有較高的相似性，但同時(shí)也具有獨(dú)特的特征。尤其在LMW-M5基因的C-端，除了含

13、有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基之外，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)額外半胱氨酸殘基。這是首次報(bào)道的含有九個(gè)半胱氨酸殘基的LMW-i型亞基，半胱氨酸殘基的增加會(huì)提高谷蛋白的粘彈性，因此LMW-M5可能為優(yōu)質(zhì)亞基。LMW-GS二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示：N-端保守區(qū)和中央重復(fù)區(qū)的氨基酸大部分或全部形成β轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)則卷曲；C-端保守區(qū)氨基酸則主要形成a螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角；四種構(gòu)象單元中，a螺旋和β折疊含量很少，β轉(zhuǎn)角較豐富。此外，在三個(gè)基因中共發(fā)現(xiàn)25個(gè)SNPs和一個(gè)插入缺失