NF-κB、EGFR、MUC1在肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管癌組織的表達(dá)和意義.pdf

1、膽管癌的發(fā)病率在全世界呈上升趨勢(shì)，約1/3的膽管癌患者合并膽管結(jié)石，而膽管結(jié)石中5％～10％將發(fā)生膽管癌。肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管癌往往以膽道結(jié)石引發(fā)的癥狀為主要表現(xiàn)，容易導(dǎo)致誤診、漏診。膽管癌的分子生物學(xué)機(jī)制目前尚未明了，肝內(nèi)膽管結(jié)石的致病作用不容忽視。
　　 1.核因子KB( Nuclear factor kappaB，NF- KB)普遍存在于細(xì)胞漿中，是一組重要的多功能轉(zhuǎn)錄因子。由于其發(fā)揮的功能廣泛，對(duì)它的研究已成為當(dāng)今熱

2、點(diǎn)。一般情況下NF- kB與其抑制蛋白I- kB結(jié)合以失活的三聚體形式存在于細(xì)胞胞漿中，只有脫離I-kB，NF-kB才能處于激活狀態(tài)。解除抑制的NF-kB因其細(xì)胞核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS)的暴露被迅速介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核DNA相應(yīng)的KB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄起始過程中，參與mRNA的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。
　　 已知NF-kB可被應(yīng)激狀態(tài)、神經(jīng)毒素、病毒及病毒

3、蛋白、細(xì)菌及其產(chǎn)物L(fēng)PS、各種細(xì)胞因子、創(chuàng)傷及紫外線等理化因素激活，以正反饋或負(fù)反饋機(jī)制參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，在病理生理變化過程中起關(guān)鍵性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，NF-kB活性增高是肝癌早期事件。
　　 2.表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種多功能跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶( tyrosine protein kinase，TPK)生

4、物活性。EGFR與其配體(如TGF-α、EGF)結(jié)合后，TPK便被活化?；罨腡PK通過兩條途徑激活細(xì)胞信號(hào)傳遞系統(tǒng)，即Ras→RafM→APK途徑，通過c-jun、c-fos將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)激活A(yù)P-1,與細(xì)胞增殖激活有關(guān)；及PI3K→PKC→IKK途徑，使IKBa磷酸化，激活NF- KB細(xì)胞外信號(hào)最終傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)EGF作為多數(shù)腫瘤的生長調(diào)節(jié)因子可以激活NF-lB信號(hào)通路，EGFR的表達(dá)也受NF-

5、kB的調(diào)控。
　　 炎癥細(xì)胞分泌的TNF-α能夠上調(diào)EGFR表達(dá)，在EGFR配體(EGF或TGF-α)作用下，氣道杯狀細(xì)胞數(shù)目增加，MUC5AC在基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)增加。
　　 3.MUC1粘蛋白是一種跨膜蛋白，正常情況下主要表達(dá)于多種組織、器官中上皮細(xì)胞近管腔或腺腔面，呈頂端表達(dá)，極性分布。在其氨基末端含有二個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)區(qū)域，與EGFR配體有很高的同源性，參與細(xì)胞生長、分化的調(diào)控。當(dāng)某種粘蛋白基因表達(dá)時(shí)，在膽管壁

6、同一周徑上的上皮細(xì)胞中均同等程度地表達(dá)其產(chǎn)物。研究表明，刺激MUC1高分泌的信號(hào)通路均經(jīng)由NF- kB路徑。
　　 MUC1基因敲除小鼠的研究表明，MUC1對(duì)小鼠的生長發(fā)育無影響，但在其體內(nèi)誘導(dǎo)的乳腺腫瘤的生長速度和轉(zhuǎn)移趨勢(shì)均降低。給MUC1基因敲除小鼠投食成石飼料，發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)膽固醇的攝取和吸收功能發(fā)生障礙，對(duì)脂肪酸的攝取卻正常。其膽囊黏膜MUC1和MUC5AC的表達(dá)顯著降低，膽囊內(nèi)粘蛋白的分泌總量顯著減少，膽固醇結(jié)晶形成和凝聚

7、明顯下降，膽囊膽固醇結(jié)石生成率顯著降低。
　　 因此，我們推測(cè)，機(jī)體內(nèi)外有效刺激因素(如應(yīng)激狀態(tài)、感染等)激活NF-k B，NF-kB通過反饋機(jī)制調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，相關(guān)細(xì)胞因子(如TNF-α)上調(diào)EGFR的表達(dá)，EGFR與其配體結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)粘蛋白的分泌和反作用于NF-kB促進(jìn)肝內(nèi)膽管結(jié)石和腫瘤的生成。為此，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色手段，觀察NF-kB、EGFR、MUC1在正常肝內(nèi)膽管組織、肝內(nèi)膽管結(jié)石、肝膽管細(xì)胞癌、肝

8、內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管癌的肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)，探討其在病理生理過程中的作用和臨床意義。
　　 研究目的
　　 1.觀察并比較NF-kB、EGFR、MUC1在正常肝內(nèi)膽管組織、肝內(nèi)膽管結(jié)石、肝膽管細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)，分析其內(nèi)在的意義。
　　 2.探討NF-k B、EGFR、MUC1在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組及肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管癌組的表達(dá)與病理組織學(xué)分級(jí)、腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系。

9、>　　 3.分析NF-k B、EGFR、MUC1表達(dá)與腫瘤病人生存的相關(guān)性。
　　 材料和方法:
　　 1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取與分組
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 134例標(biāo)本取自1989年08月至2009年06月期間在中山大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)切除肝組織標(biāo)本，均為石蠟包埋。男性71例，女性63例，年齡32歲～77歲，平均年齡58.8±10.7歲。所有病例在術(shù)前均沒有接受放、化療及抗炎治療。肝內(nèi)膽管結(jié)石合并肝內(nèi)膽管癌

10、33例，平均年齡58.1±7.9歲；膽管細(xì)胞癌型肝癌44例，平均年齡59.1±10.5歲；肝內(nèi)膽管結(jié)石32例，平均年齡55.5±9.3歲，為實(shí)驗(yàn)組；三組間年齡比較，F(xiàn)=1.398，P=0.252,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常的肝內(nèi)膽管組織25例為對(duì)照組，取自肝細(xì)胞型肝癌瘤旁2～3cm正常肝組織，均在光學(xué)顯微鏡下證實(shí)無炎癥、結(jié)石、纖維化、不典型增生、癌變等病理改變。
　　 1.2標(biāo)本處理
　　 標(biāo)本經(jīng)冷生理鹽水漂洗5min后，1

11、0％中性福爾馬林溶液固定24小時(shí)以上，脫水，然后常規(guī)石蠟包埋。將石蠟包埋組織塊在切片機(jī)上制成3～5μm厚的切片，進(jìn)行蘇木素一伊紅(HE)染色及常規(guī)病理組織學(xué)檢查。
　　 1.3免疫組化染色
　　 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。新鮮配制3％ H2O2中室溫滅活內(nèi)源性酶10 min，蒸餾水洗滌3次×3 min。EGFR用胃酶消化，370oC15min：MUC1、NF-kB用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液中行微波抗原修復(fù)(解凍檔)15 mi

12、n，冷卻至室溫，0.1M PBS漂洗3次×3 min。滴加血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體。滴加一抗(抗體稀釋度均為1：50)，4℃過夜，0.1M PBS漂洗3次×3 min。滴加二抗，37℃孵育45 min，0.1M PBS漂洗3次×3 min。滴加S-P復(fù)合物，37℃孵育60 min，0.1M PBS漂洗3次×3 min。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片。
　　 1.4 NF-k B表達(dá)的觀

13、察
　　 在普通光學(xué)顯微鏡20×10倍視野下觀察，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞漿或/及細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃褐色的均質(zhì)或顆粒樣物質(zhì)即為陽性。
　　 1.5 EGFR表達(dá)的觀察
　　 在普通光學(xué)顯微鏡20×10倍視野下觀察，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞漿或/及細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃褐色的均質(zhì)或顆粒樣物質(zhì)即為陽性。
　　 1.6 MUC1表達(dá)的觀察
　　 在普通光學(xué)顯微鏡20×10倍視野下觀察，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞漿或/及腺管上皮細(xì)胞膜靠近腺腔