一例家族性高膽固醇血癥致病基因突變的研究.pdf

1、【目的】 家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H；MIM 143890 )是一種常染色體顯性遺傳性疾病，是脂質(zhì)代謝疾病中最嚴(yán)重的一種。FH引起動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As）病變，導(dǎo)致早期發(fā)生較為嚴(yán)重的冠心?。╟oronary artery disease，CAD）。新近發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)H存在一些亞型，其中常染色體隱性遺傳性高膽固醇血癥（The autosomal rec

2、essive hypercholesterolemia, ARH， MIM 603813）純合患者臨床表現(xiàn)與FH極為相似，也可表現(xiàn)為膽固醇水平異常升高、皮膚肌腱黃色瘤和早發(fā)的冠心病，嚴(yán)重危害人類健康。 為探討FH患者低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein-Receptor,LDL-R）功能特點(diǎn)及可能的致病基因，分析FH患者LDL-R結(jié)合活性與臨床表型之間的關(guān)系，揭示FH的分子病理機(jī)制，本課題（一）采集了

3、一個(gè)經(jīng)臨床診斷為FH的家系，對(duì)其家系成員進(jìn)行血脂等臨床檢測(cè)分析，從基因和受體功能水平分析了先證者及其父母LDL-R的表達(dá)，同時(shí)建立了永生化細(xì)胞株及快速、有效、便捷的研究方法對(duì)淋巴細(xì)胞表面LDL-R蛋白結(jié)合與攝取LDL的活性進(jìn)行檢測(cè)；（二）通過對(duì)可疑ARH患者ARH突變基因的研究，探討ARH基因突變與其造成的功能損傷間的關(guān)系，臨床確診為FH患者，觀察其低密度脂蛋白受體基因是否存在大片段的缺失，探討LDL-R基因缺失與FH之間的關(guān)系。

4、 【方法】 以一家族性隱性高膽固醇血癥家系為研究對(duì)象，對(duì)其成員進(jìn)行常規(guī)體格檢查、血脂等生化指標(biāo)的測(cè)定，并對(duì)先證者及其父母進(jìn)行了心血管超聲等更為細(xì)致的檢查。分離培養(yǎng)先證者及父母外周血淋巴細(xì)胞，以含10％無脂血清（Lipoprotein deficiency serum, LPDS）的1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)其LDL-R的最大活性后，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）標(biāo)記的LDL，分別

5、于4℃和37℃孵育2小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表面結(jié)合、攝取LDL的平均熒光強(qiáng)度。同時(shí)，檢測(cè)了患者及其父母淋巴細(xì)胞LDL-R蛋白水平。運(yùn)用PCR與直接測(cè)序法檢測(cè)了Apo B100基因突變；同一反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增LDL-R基因21個(gè)片段，直接測(cè)序法檢測(cè)LDL-R基因突變；Southern Blot檢測(cè)LDL-R基因的缺失情況；PCR與直接測(cè)序法檢測(cè)ARH基因突變。 [結(jié)果] 我們成功將FH患者及家屬的外周血淋巴細(xì)胞永生

6、化，永生化淋巴細(xì)胞明顯增大，胞質(zhì)突出，形態(tài)各異，聚集成團(tuán)的細(xì)胞株。FH先證者淋巴細(xì)胞表面LDL-R對(duì)LDL的結(jié)合與攝取活性均較正常人明顯降低，少量細(xì)胞尚有殘余的受體結(jié)合功能。Apo B100 基因未發(fā)現(xiàn)突變，其LDL-R基因以目前采用的方法未檢測(cè)到點(diǎn)突變或片段缺失的存在，進(jìn)一步研究未發(fā)現(xiàn)ARH基因突變。 [結(jié)論] 1.永生化前后淋巴細(xì)胞LDL-R受體表達(dá)功能無改變； 2.FH先證者LDL-R蛋白水平表達(dá)明顯下