構(gòu)建β-catenin特異的RNAi慢病毒載體研究Wnt-β-catenin信號(hào)通路對小鼠胰島β細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建β-連環(huán)蛋白(β-catenin)特異的RNAi慢病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制β-catenin基因表達(dá)，為研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi慢病毒感染小鼠胰島β細(xì)胞(Min6)，觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路對Min6細(xì)胞增殖的影響。 方法：設(shè)計(jì)合成針對β-catenin mRNA不同位點(diǎn)的shRNA編碼序列，連接克隆到慢病毒載體質(zhì)粒中；并通過構(gòu)建過表達(dá)β-cateni

2、n的真核載體，與構(gòu)建的RNAi慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞，利用Western Blot外源性篩選有效干擾質(zhì)粒；然后與輔助載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝病毒、逐孔稀釋法進(jìn)行病毒滴度測定。RNAi慢病毒感染Min6細(xì)胞，Real time PCR(RT-PCR)和Western Blot法內(nèi)源性驗(yàn)證其對細(xì)胞內(nèi)β-catenin基因的抑制效果。利用有效的RNAi慢病毒抑制Min6細(xì)胞β-catenin表達(dá)，下調(diào)Wnt信號(hào)，MTT法檢測

3、經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對Min6細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：1、成功構(gòu)建了針對β-連環(huán)蛋白基因不同位點(diǎn)的RNAi慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR和測序鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確；成功構(gòu)建了β-catenin基因過表達(dá)真核生物載體質(zhì)粒，與鑒定正確的慢病毒載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western Blot檢測表明構(gòu)建的載體質(zhì)粒能夠有效敲減細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平；將重組慢病毒載體質(zhì)粒與輔助包裝載體質(zhì)粒一起

4、共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝、擴(kuò)增慢病毒，獲得高滴度慢病毒上清。2、RT-PCR和Western Blot檢測RNAi慢病毒感染Min6細(xì)胞后，可以高效抑制β-catenin基因的表達(dá)。3、有效的RNAi慢病毒感染Min6細(xì)胞下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路后可以明顯抑制胰島β細(xì)胞的增殖。 結(jié)論：構(gòu)建的特異RNAi慢病毒能夠有效抑制β-catenin基因的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)目的基因mRNA和蛋白的水平，可以作為研究Wnt/β-c