六倍體小黑麥、人工合成小麥及普通小麥籽粒硬度形成的分子基礎(chǔ).pdf

1、籽粒硬度是影響小麥?zhǔn)称芳庸て焚|(zhì)的重要性狀之一，研究籽粒硬度形成的生化和分子基礎(chǔ)對(duì)于小麥品質(zhì)改良具有重要意義。本研究以來(lái)自CIMMYT的171份六倍體小黑麥和57份人工合成小麥作為研究材料，利用單籽粒谷物特性測(cè)試儀和。PCR擴(kuò)增、酶切及DNA測(cè)序技術(shù)，結(jié)合改良的friabilin提取及電泳分析方法，研究其籽粒硬度形成的生化和分子機(jī)理。對(duì)山東省的431個(gè)農(nóng)家品種、63個(gè)歷史品種和29個(gè)當(dāng)前主栽品種的籽粒硬度分布以及Pina和Pinb等位變異

2、類型進(jìn)行了研究，探討山東小麥籽粒硬度的演變規(guī)律。將構(gòu)建完成的Pina和Pinb融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入四倍體的硬粒小麥中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行Pina和Pinb基因功能的驗(yàn)證。主要研究結(jié)果分為以下四個(gè)部分： 1．171份六倍體小黑麥的籽粒硬度變異范圍很大，最軟的SKCS值為8.6，最硬的為84．9。軟質(zhì)小黑麥的friabilin表達(dá)量顯著高于硬質(zhì)小黑麥，說(shuō)明friabilin蛋白直接參與小黑麥籽粒硬度的形成。發(fā)現(xiàn)了控制小黑麥friabil

3、in蛋白表達(dá)的Secaloindoline-a和Secaloindoline-b等位基因，分別命名為．Sina一尺J6和．Sinb-RIc，其編碼蛋白命名為SINAb和SINBc。與SINAa相比較，SINAb在第44個(gè)氨基酸處由色氨酸(Trp)變?yōu)榫彼?Arg)。與SINBa相比，SINBc有多處氨基酸組成的改變，其中78位的甘氨酸(Gly)變?yōu)榻z氨酸(Set)，115位的甘氨酸(Gly)變?yōu)榫彼?Arg)，而且在信號(hào)肽區(qū)域有一個(gè)

4、半胱氨酸(Cys)的插入。 2．57份人工合成六倍體小麥?zhǔn)怯梢吧Ｐ←溑c山羊草雜交形成的，其SKCS硬度值變異較大，從10.5到42.6，其中15到30之間的占78％。共有Pina-Dla、Pina-Dlc、Pinb-Dlh和Pinb-DIj四種等位變異型，基因型為Pina-Dla/Pinb-DIj的8個(gè)，占14％，基因型為Pina-Dlc/Pinb-Dlh的49個(gè)，占86％?；蛐蚉ina-Dla/Pinb-DIj與Pina

5、-Dlc/Pinb-Dlh對(duì)籽粒硬度的影響差異不顯著，但父本山羊草和母本野生二粒小麥以及二者間的互作對(duì)籽粒硬度有顯著影響，說(shuō)明除了Pina和Pinb外，還有其他微效基因影響籽粒硬度的形成。 3．山東農(nóng)家品種、歷史品種和當(dāng)前主栽品種的籽粒硬度具有不同的分布特點(diǎn)，軟質(zhì)、硬質(zhì)和混合麥比例在不同時(shí)期有顯著變化。農(nóng)家品種、歷史品種和當(dāng)前主栽品種中硬質(zhì)麥比例分別為75.6％、12.7％和27.6％，混合麥分別占20.4％、19.0％和13.

6、8％，而軟質(zhì)麥分別占3.9％、68.3％、和58.6％。農(nóng)家品種中共有6種基因型，Pina-Dlb/Pinb-Dla和Pina-Dla/Pinb-Dlp分別占38％和59.6％。歷史品種中有4種基因型，Pina-DIb/Pinb-Dla占23-1％，Pina-Dla/Pinb-Dlb占53.9％，而Pina-Dla/Pinb-Dlp只占15.4％。當(dāng)前主栽品種中8份硬質(zhì)麥全部是Pina-Dla/Pinb-Dlb類型。長(zhǎng)芒透垅白等3個(gè)品種

7、的Pinb基因的核營(yíng)酸序列發(fā)生了雙突變，起始密碼子下游的96bp處堿基C突變?yōu)锳，而且在265bp處發(fā)生了A堿基的缺失，命名為Pinb-Dlp+。 根據(jù)Pina基因的保守序列設(shè)計(jì)引物Pina-DF/Pina-DR，對(duì)參試材料進(jìn)行Pina-Dlb的PCR檢測(cè)，PINA蛋白表達(dá)分析結(jié)合Pinb基因型的鑒定表明，該引物作為Pina-Dlb的分子標(biāo)記，準(zhǔn)確可靠。 4．以軟質(zhì)小麥京411作為Pina和Pinb基因的供體，將Pina

8、、Pinb基因融合后，與基礎(chǔ)質(zhì)粒pG4AB上的O和poly(A)等增強(qiáng)基因表達(dá)的調(diào)控序列及pAHC25上的Ubiqutin啟動(dòng)子和bar基因表達(dá)盒相連接，完成了Pina、Pinb融合基因植物高效表達(dá)載體pFUBPaPb的構(gòu)建。利用基因槍轉(zhuǎn)化硬粒小麥幼胚16000多枚，得到再生植株2390棵。經(jīng)biolaphos篩選和PCR鑒定，35棵為陽(yáng)性植株，共得到T<,1>代籽粒356粒，對(duì)種子量較多的16個(gè)T<,1>單株籽粒進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，其中