甘藍型油菜隱性細胞核雄性不育基因ms3的精細定位.pdf

1、9012AB是甘藍型油菜隱性細胞核不育材料中的一種,其具有敗育徹底、不育性穩(wěn)定、恢復(fù)源廣泛及無不良胞質(zhì)效應(yīng)等特點。遺傳分析研究表明,該不育材料的育性受兩對隱性重疊不育基因(ms3ms3,ms4ms4)和一對隱性上位抑制基因(rfrf)互作控制；兩對不育基因隱性純合時可導(dǎo)致雄性不育,而上位抑制基因隱性純合時則可抑制不育基因的表達,使育性恢復(fù)正常(陳鳳祥等,1998)。依照此遺傳模式,9012AB不育系可以實現(xiàn)三系配套,從而解決核不育制種時

2、需拔除50％可育株的問題。因此,近年來該系統(tǒng)引起了研究者的廣泛關(guān)注；目前,利用該系統(tǒng)的育種工作已取得突破,對其不育控制機理的初步研究也已展開。以9012AB為主要研究材料,柯麗萍(2005)已將其中一個不育基因(ms3)初步定位在0.5cM的遺傳區(qū)間。以此為基礎(chǔ),本研究進一步開展了隱性核不育基因ms3的精細定位研究,取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1.以9012AB近等基因系為材料,應(yīng)用重組單株BSA法,結(jié)合AFLP技術(shù),繼續(xù)

3、篩選了2048對引物組合,獲得了21個與目標(biāo)基因更為緊密連鎖的AFLP分子標(biāo)記。其中有2個標(biāo)記(AH15、AH17)在所用群體中與目標(biāo)基因共分離,14個標(biāo)記(AH1、AH2、AH3、AH4、AH6、AH8、AH9、AH10、AH11、AH13、AH18、AH19、AH20、AH21)位于目標(biāo)基因的一側(cè),5個標(biāo)記(AH5、AH7、AH12、AH14、AH16)位于目標(biāo)基因的另一側(cè)。兩側(cè)最近分子標(biāo)記在1506株的近等基因系群體中將ms3基因

4、限定在0.14cM的遺傳區(qū)間。
　　 2.將AFLP標(biāo)記AH2、AH6、AH15、AH9、AH16和AH22、AH23(王貴春博士提供)成功轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記(依次命名為SW0、SW1、SW2、SW3、SW4、SW5、SW6)。分別利用6,407、4,768和8,041個單株的9012AB分離群進一步分析上述SCAR標(biāo)記與ms3基因的連鎖關(guān)系。結(jié)果顯示SCAR標(biāo)記SW2、SW5、SW6依然與目標(biāo)基因共分離,兩側(cè)最近標(biāo)記SW

5、1和SW4與目標(biāo)基因間的遺傳距離均為0.029cM,ms3基因被界定在0.058cM的遺傳區(qū)段,實現(xiàn)了目標(biāo)基因的精細遺傳定位。
　　 3.Blastn分析表明:標(biāo)記AH2、AH6、AH9、AH15、AH16、AH22、AH23序列及其側(cè)翼序列與擬南芥第5染色體上的部分序列具有較高的同源性,且標(biāo)記在甘藍型油菜基因組中的排列順序與其同源區(qū)在擬南芥基因組中的排列順序基本一致,覆蓋擬南芥同源區(qū)約576kb的物理距離。據(jù)此推斷,甘藍型油菜

6、中ms3基因所在區(qū)段在擬南芥基因組中存在一個共線性較好的區(qū)域。
　　 4.根據(jù)擬南芥同源區(qū)中已定位的油菜、甘藍和白菜的ESTs、GSSs序列及擬南芥的基因組序列,設(shè)計引物開發(fā)出了6個與ms3基因緊密連鎖的ACGM標(biāo)記(AR23、AR44、AR45、AR48、AR52、AR53)。群體驗證及重組單株分析發(fā)現(xiàn),AR23與SW4同側(cè)且與其共分離,另外5個ACGM標(biāo)記與SW1同側(cè)且與目標(biāo)位點均有唯一的交換單株;至此,目標(biāo)基因被進一步縮小

7、至0.034cM的遺傳范圍內(nèi)。
　　 5.以目標(biāo)基因兩側(cè)標(biāo)記AH9、AH16的側(cè)翼序列,及共分離標(biāo)記AH15的SCAR標(biāo)記SW2和AH17的側(cè)翼序列為探針,篩選TapidorBAC文庫,得到86個具有強雜交信號的BAC克隆。PCR分析從中鑒定出14個陽性克隆,但它們之間并不能形成一個完整的跨疊克隆群。
　　 6.以上述陽性克隆中BAC克隆o的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物為探針,再次篩選TapidorBAC文庫,得到48個陽性克隆。PCR