甘藍(lán)型油菜矮稈基因定位、克隆及功能分析.pdf

1、株高是株型的重要組成部分，也是影響作物產(chǎn)量的重要基礎(chǔ)性狀。小麥和水稻半矮稈基因的應(yīng)用是第一次“綠色革命”成功的關(guān)鍵。半矮稈基因的利用顯著降低了水稻和小麥植株的高度，增強(qiáng)了植株的倒伏抗性、耐肥性，同時(shí)還提高了收獲指數(shù)，從而顯著地增加了水稻和小麥的產(chǎn)量。油菜是我國(guó)重要的油料作物之一，現(xiàn)有的油菜品種植株高大，易因倒伏而導(dǎo)致產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降。油菜矮稈突變體較少，對(duì)油菜株型調(diào)控的分子機(jī)理研究有限。因此，篩選矮稈突變體，克隆相關(guān)基因，闡明油菜株高

2、的形成機(jī)制，對(duì)于油菜的矮化育種具有重要意義。本研究以甘藍(lán)型油菜（Brassica napus，AACC，2n=38）矮稈突變體ds-3為材料，對(duì)株高基因DS-3進(jìn)行了遺傳定位，并最終克隆了控制矮稈性狀的矮稈基因ds-3，該基因編碼赤霉素(GA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子DELLA蛋白，命名為BnaC07.rga-ds。本研究還對(duì)BnaC07.rga-ds及其同源基因進(jìn)行了功能分析。此外，本研究對(duì)油菜矮稈突變體ds-4的矮稈基因進(jìn)行了精細(xì)定位。主要

3、結(jié)果如下:
　　1.矮稈基因DS-3的定位、克隆以及功能驗(yàn)證
　　突變體ds-3苗期葉片暗綠，植株匍匐生長(zhǎng)。成熟期，植株株高及其各構(gòu)成因子:第一分枝高度，節(jié)間數(shù)目，節(jié)間長(zhǎng)度以及主花序長(zhǎng)度均顯著降低。此外，ds-3下胚軸的伸長(zhǎng)對(duì)外源GA3處理的敏感性減弱。
　　F1雜種的株高介于ds-3與野生型“華雙5號(hào)”之間;BC1和F2群體株高分離比分別符合1∶1和1∶2∶1的預(yù)期值，表明矮稈性狀受單個(gè)不完全顯性基因控制。BSA分析

4、將目標(biāo)基因DS-3定位在C07染色體兩個(gè)SSR標(biāo)記（BoGMS4033和BoGMS4044）之間，兩個(gè)標(biāo)記之間的遺傳距離為6 eM。DS-3基因一側(cè)4個(gè)連鎖的SSR標(biāo)記對(duì)應(yīng)的C07染色體區(qū)段與A06染色體上株高基因BnaA06.RGA區(qū)段存在很好的共線性。在C07染色體目標(biāo)區(qū)間內(nèi)，存在與BnaA06.RGA同源的BnaC07.RGA，因此后續(xù)研究中將BnaC07.RGA作為DS-3的候選基因。
　　比較測(cè)序發(fā)現(xiàn)，突變體ds-3的B

5、naC07.rga-ds基因編碼區(qū)第272位核苷酸發(fā)生了C→T突變，該突變導(dǎo)致DELLA蛋白N端保守結(jié)構(gòu)域VHYNP的脯氨酸(P)被替換成亮氨酸(L)。位點(diǎn)特異性標(biāo)記分析結(jié)果表明，該點(diǎn)突變與F2和BC1群體株高共分離。在擬南芥中分別表達(dá)BnaC07.RGA和BnaC07.rga-ds，BnaC07.RGA的轉(zhuǎn)基因植株株高與野生型沒有顯著差異，而BnaC07.rga-ds能顯著降低植株高度。酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示:GA能介導(dǎo)BnaC07.

6、RGA與受體GID1a的結(jié)合，但不能介導(dǎo)BnaC07.rga-ds與GID1a的互作。
　　2.甘藍(lán)型油菜RGA的拷貝數(shù)、進(jìn)化分析及功能鑒定以擬南芥AtRGA的氨基酸序列，進(jìn)行雙向BLASTp比對(duì)，在白菜、甘藍(lán)以及甘藍(lán)型油菜基因組中分別鑒定到2個(gè)BraRGA基因，2個(gè)BolRGA基因以及4個(gè)BnaRGA基因。基于核苷酸序列的進(jìn)化樹以及氨基酸序列一致性的分析結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，油菜的4個(gè)BnaRGA基因來源于白菜的2個(gè)BraRGA基因以及甘

7、藍(lán)的2個(gè)BolRGA基因，構(gòu)成4個(gè)直系同源基因?qū)?
　　RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ds-3的4個(gè)BnaRGAs基因在莖稈與葉片中均有表達(dá); GA處理能增強(qiáng)BnaRGA基因表達(dá)，但其響應(yīng)GA的模式不盡相同。酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA能介導(dǎo)各BnaRGA蛋白與GID1a互作。此外，通過比較ds-1與ds-3兩矮稈突變位點(diǎn)對(duì)株高的影響發(fā)現(xiàn)，DS-3(BnaC07.RGA)對(duì)莖稈伸長(zhǎng)的調(diào)控力要弱于DS-1(BnaA06.RGA)。
　

8、　3.矮稈基因DS-4的精細(xì)定位
　　矮稈突變體ds-4幼苗期葉片皺縮、向下卷曲，植株匍匐生長(zhǎng)，成熟期植株矮小。此外，ds-4的種子萌發(fā)率較低，下胚軸變短明顯，開花前期莖頂端表現(xiàn)出輕微的正向地性，但暗形態(tài)建成表現(xiàn)正常。
　　將矮稈突變體ds-4和野生型ZY821雜交，比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1的株高遠(yuǎn)低于中親值，更接近矮稈親本ds-4;F2和BC1群體植株可以明顯地劃為矮稈類型和正常類型，而且矮稈類型和正常類型的分離比分別符合3∶1和1

9、∶1。
　　BSA分析將目標(biāo)基因DS-4定位于油菜C05染色體介于InDel標(biāo)記ID-147與ID-162之間25.6 cM的區(qū)間內(nèi)。隨后，基于雙親重測(cè)序的數(shù)據(jù)在目標(biāo)區(qū)間開發(fā)了4個(gè)連鎖的CAPS標(biāo)記，利用這些標(biāo)記從F2群體高稈表型的植株中篩選交換單株，進(jìn)而將DS-4定位在SNP2CAPS-1和SNP2CAPS-4之間4.1 M的物理區(qū)間。隨后，在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)開發(fā)了多個(gè)SNP標(biāo)記，利用SNPseq(R)分型技術(shù)篩選BC1F2分離群體中