狂犬病毒先導(dǎo)RNA及其宿主互作蛋白的功能研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患傳染病，人與所有的溫血?jiǎng)游锒家赘胁⒖蓚鞑ゲ《?。該病在全球分布廣泛，且一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100％，因此給人類健康帶來巨大的威脅。全球每年有5.9萬人因狂犬病死亡，其中有絕大部分發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國(guó)家?？袢《緦儆诳袢《緦?gòu)棤畈《究疲《净蚪M編碼五種結(jié)構(gòu)蛋白，病毒在轉(zhuǎn)錄的過程中不僅產(chǎn)生這五種結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA，也會(huì)產(chǎn)生一段5'端沒有帽子結(jié)構(gòu)，3'端沒有polyA尾巴的非編碼RNA，名為先導(dǎo)RNA

2、。
　　有研究用末端標(biāo)記的狂犬病毒基因組與被固定毒感染12小時(shí)的BHK-21細(xì)胞產(chǎn)物做雜交，檢測(cè)到狂犬病毒感染后產(chǎn)生的先導(dǎo)RNA，長(zhǎng)度主要是56 nt和58 nt，其中56 nt的先導(dǎo)RNA的量約是58 nt長(zhǎng)度的兩倍。并且檢測(cè)被固定毒感染24小時(shí)的細(xì)胞時(shí)，結(jié)果相同，但先導(dǎo)RNA的量比感染后12小時(shí)少。該研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了先導(dǎo)RNA有其他的長(zhǎng)度，如43 nt、60 nt。狂犬病毒和水泡性口炎病毒的核蛋白都能通過與先導(dǎo)RNA的互作來

3、影響病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制之間的轉(zhuǎn)換，決定了病毒是以轉(zhuǎn)錄為主還是以復(fù)制為主。在狂犬病毒感染時(shí)，狂犬病毒核蛋白與先導(dǎo)RNA的互作比核蛋白與核蛋白mRNA的互作、核蛋白和其他非病毒RNA的互作都更強(qiáng)，證明與非病毒RNA和病毒的mRNA相比，核蛋白會(huì)優(yōu)先結(jié)合先導(dǎo)RNA。核蛋白和磷蛋白同時(shí)表達(dá)時(shí)，磷蛋白會(huì)使核蛋白結(jié)合其他RNA的能力降低，但不影響核蛋白結(jié)合先導(dǎo)RNA。但是，先導(dǎo)RNA本身的作用以及先導(dǎo)RNA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制并不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在研究先導(dǎo)RN

4、A的產(chǎn)生、功能以及與宿主之間的關(guān)系。
　　以狂犬病毒街毒株DRV-AH08作為研究對(duì)象，來研究狂犬病毒的先導(dǎo)RNA。DRV-AH08感染小鼠后提取總RNA建先導(dǎo)RNA文庫，通過Sanger測(cè)序我們發(fā)現(xiàn)，DRV-AH08的先導(dǎo)RNA形式多樣，但最主要的長(zhǎng)度是64 nt。隨后我們用DRV-AH08感染SK-N-SH細(xì)胞，并在感染早期提取總RNA建先導(dǎo)RNA文庫，然后做高通量測(cè)序，高通量測(cè)序的結(jié)果顯示先導(dǎo)RNA的主要長(zhǎng)度仍是64 nt。

5、雖然先導(dǎo)RNA長(zhǎng)度不同，但是我們預(yù)測(cè)了56 nt、58 nt和64 nt的先導(dǎo)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。為了進(jìn)一步研究先導(dǎo)RNA的功能，我們利用人類腺病毒表達(dá)載體，在細(xì)胞中和活體中過表達(dá)先導(dǎo)RNA。首先是細(xì)胞中，用表達(dá)載體過表達(dá)不同長(zhǎng)度的先導(dǎo)RNA，然后感染不同劑量的狂犬病毒（0.01MOI和0.1MOI）發(fā)現(xiàn)56 nt、58 nt和64 nt長(zhǎng)度的先導(dǎo)RNA均能抑制狂犬病毒的感染，并且我們用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的64nt先導(dǎo)R

6、NA轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證了先導(dǎo)RNA對(duì)狂犬病毒感染的抑制作用。然后我們將過表達(dá)先導(dǎo)RNA和過表達(dá)對(duì)照RNA的人類腺病毒通過腦三維立體定位注射的方式分別注射到同一只小鼠的左右腦海馬區(qū)，再感染狂犬病毒，最后發(fā)現(xiàn)在活體水平過表達(dá)先導(dǎo)RNA仍然能抑制狂犬病毒的感染。
　　同時(shí)我們也在SK-N-SH細(xì)胞中再次驗(yàn)證了，過表達(dá)先導(dǎo)RNA時(shí)，狂犬病毒的基因組RNA顯著性減少。通過RNA免疫共沉淀試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，先導(dǎo)RNA存在時(shí)，能抑制狂犬病毒核蛋白與基因組

7、RNA結(jié)合。這表明，先導(dǎo)RNA可以通過抑制核蛋白與基因組結(jié)合來抑制狂犬病毒的復(fù)制。
　　RNA和蛋白互作試驗(yàn)證實(shí)宿主中的熱休克同源70 KD蛋白，Hsc70，可以與先導(dǎo)RNA互作，并且這種互作是直接的互作。Hsc70和先導(dǎo)RNA互作3D結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果顯示，Hsc70的核酸結(jié)合區(qū)域可能是結(jié)合了先導(dǎo)RNA51 nt-59 nt的AU富集區(qū)。抑制Hsc70的表達(dá)可以促進(jìn)先導(dǎo)RNA的水平升高。同時(shí)Hsc70表達(dá)水平降低，會(huì)導(dǎo)致狂犬病毒的復(fù)制

8、減少。而反過來，狂犬病毒感染后也會(huì)影響Hsc70的表達(dá)，狂犬病毒感染后2小時(shí)，Hsc70的水平顯著下降，但是感染后36小時(shí)，Hsc70的水平又顯著升高。這種不同的變化促使我們進(jìn)一步研究了Hsc70、先導(dǎo)RNA和病毒基因組RNA之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)狂犬病毒感染早期會(huì)抑制Hsc70的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致先導(dǎo)RNA含量增加，進(jìn)而抑制了病毒的復(fù)制，而在感染晚期，Hsc70的表達(dá)水平升高，先導(dǎo)RNA含量下降，病毒開始大量復(fù)制。這種病毒自我調(diào)節(jié)復(fù)制的現(xiàn)象