高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對大鼠脊髓損傷神經(jīng)保護作用及機制的實驗研究.pdf

1、本實驗采用SD大鼠為脊髓損傷打擊模型，分組給予高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理，觀察預(yù)處理對脊髓損傷的神經(jīng)保護效應(yīng)，并對保護機制進行初步探討，同時對高壓氧治療脊髓損傷的療效給予評估。本文共分為以下三個部分內(nèi)容： 一、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)保護效應(yīng)的實驗研究 目的：通過建立高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理脊髓損傷動物模型，觀察預(yù)處理對成年大鼠急性脊髓損傷后不同時期神經(jīng)功能的影響，以探討預(yù)處理對脊髓損傷后的神經(jīng)保護效應(yīng)。

2、 方法： 1、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理動物模型的建立：成年雌性大鼠隨機分組后，利用實驗動物高壓氧艙和低壓氧艙，在相應(yīng)的實驗條件下，分別預(yù)處理5天。 2、脊髓損傷模型的建立：麻醉狀態(tài)下，手術(shù)顯露椎管及硬膜囊，用30g沖擊棒自5cm高度自由落體下墜致傷脊髓。沖擊棒下端直徑3mm，致傷能量為150gcf，建立脊髓損傷模型。 3、觀察項目： (1)行為學(xué)評價：采用BBB運動功能評分法，分別在脊髓損傷后1d、1w

3、、2w、4w和8w進行評分。 (2)誘發(fā)電位的測定：各組大鼠分別在損傷后不同時期測定體感誘發(fā)電位和運動誘發(fā)電位檢測。 (3)透射電鏡：灌注固定后取損傷區(qū)中心1mm3置入10％戊二醛液，制片，電鏡下觀察采圖。 (4)HE染色光鏡下觀察：各組大鼠分別在損傷后不同時期灌注固定取材，行脊髓矢狀和冠狀石蠟切片的HE染色觀察。 (5)神經(jīng)束路示蹤：生物素化萄聚糖胺順行示蹤和辣根過氧化物酶逆行示蹤，觀察上行和下行軸突再

4、生情況，預(yù)處理對軸突再生的影響。 4、實驗內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計處理。 結(jié)果： 1、本實驗高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理及大鼠脊髓打擊傷模型建立可靠穩(wěn)定，具有較好的可重復(fù)性。 2、大鼠脊髓打擊模型在傷后1dBBB評分為0分，1w為2.86±1.03分，以后逐漸恢復(fù)，8w為14.12±2.15分，經(jīng)高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理后在各時期與非預(yù)處理損傷組相比較。 3、運動誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位的潛

5、伏期在脊髓損傷后明顯延長，在1w-4w各時期與非預(yù)處理損傷組相比較，潛伏期縮短，低壓缺氧預(yù)處理組更為明顯，差異有顯著性(p＜0.05)，4w后相對穩(wěn)定。 4、光鏡及電鏡觀察：脊髓損傷后1d可見，損傷區(qū)中央灰質(zhì)出現(xiàn)大片出血、細胞腫脹、尼氏體消失，并有大量單核或多核炎性細胞浸潤；脊髓損傷第1w損傷區(qū)組織出現(xiàn)大片壞死灶，炎性反應(yīng)加劇；2w后脊髓損傷及周圍區(qū)炎性細胞浸潤減輕，4w損傷脊髓組織出現(xiàn)囊腔樣變化，8w以膠質(zhì)瘢痕為主。

6、結(jié)論： 1、大鼠打擊傷SCI模型與人類SCI有一定相似性，個體差異不明顯，模型制備簡單，穩(wěn)定重復(fù)性強。 2、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理后，大鼠在脊髓損傷后不同時期脊髓功能改善，運動誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位潛伏期縮短，病理變化減輕，神經(jīng)束路示蹤標志陽性纖維明顯增多，提示對大鼠脊髓損傷均有神經(jīng)保護作用。 3、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對大鼠脊髓損傷具有一定的神經(jīng)保護作用。(本實驗建立的是中度脊髓損傷模型)。 4、在本實

7、驗條件下，低壓缺氧預(yù)處理對脊髓損傷的內(nèi)源性保護作用較高壓氧預(yù)處理的保護作用更為顯著。 二、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)保護作用機制的探討 目的：探討高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)保護作用機制，為脊髓損傷的防治提供理論基礎(chǔ)。 方法：預(yù)處理及脊髓打擊傷實驗動物模型建立分組后，在不同時期內(nèi)取材，行免疫組織化學(xué)染色，RT-PCR和Westblot(蛋白印跡法)檢測，觀察預(yù)處理對脊髓損傷后神經(jīng)細胞

8、凋亡、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮生長因子、軸突生長抑制因子和嘌呤受體的影響。實驗內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計處理。 觀察項目： 1、神經(jīng)細胞凋亡，TUNEL染色觀察 2、GFAP免疫組織化學(xué)染色觀察 3、Nestin免疫組織化學(xué)染色觀察 4、VEGF免疫組織化學(xué)染色觀察 5、Nogo免役組織化學(xué)染色觀察 6、P2X7嘌呤受體mRNA和蛋白的定量 觀察結(jié)果

9、： 1、非預(yù)處理脊髓損傷1dTUNEL陽性細胞逐漸增多，分布不均勻，灰質(zhì)和白質(zhì)中均可見。 2、GFAP表達于正常脊髓的中央灰質(zhì)和周圍白質(zhì)。 3、預(yù)處理后1w-4w表達增加，尤其以低壓缺氧預(yù)處理組更為顯著。 4、非預(yù)處理SCI1dVEGF在大鼠脊髓損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)高表達，主要出現(xiàn)在軟脊膜和脊髓灰、白質(zhì)血管壁上的血管內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)，脊髓灰、白質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞和巨噬細胞胞漿內(nèi)也出現(xiàn)表達，。 5、非預(yù)

10、處理SCI后1d，在脊髓損傷區(qū)中央，未見到nogo陽性細胞。2w后，損傷區(qū)附近白質(zhì)，nogo陽性免疫細胞有少量表達，SCI后8w，見膠質(zhì)瘢痕區(qū)nogo陽性表達反應(yīng)，并且nogo表達陽性區(qū)與膠質(zhì)瘢痕區(qū)相一致。 6、SCI后P2X7受體的表達變化：在低壓缺氧預(yù)處理組，傷后12h、3d、5d目的條帶幾乎不可見，而高壓氧預(yù)處理組和非預(yù)處理損傷組卻表現(xiàn)明顯，尤其高壓氧預(yù)處理組在12h表達更為明顯。傷后7d三組無明顯差異。 結(jié)論：

11、 1、高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理均可以通過抑制神經(jīng)細胞凋亡起到神經(jīng)保護作用。 2、在脊髓損傷的早期(本實驗觀察到為2w之內(nèi))，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理均可以促進星形膠質(zhì)細胞活化，起到保護神經(jīng)元的作用。脊髓損傷后期(本實驗觀察到為4w之后)，高壓氧預(yù)處理有促進膠質(zhì)細胞過度增生，增強膠質(zhì)瘢痕形成的可能。 3、脊髓損傷后可以激活神經(jīng)干細胞或前體細胞，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理均可以促進神經(jīng)干細胞增殖和分化，尤其低壓缺氧預(yù)處理更為顯

12、著。 4、脊髓損傷可以導(dǎo)致內(nèi)源性VEGF在脊髓實質(zhì)中的表達增強，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理可以促進這一過程，通過促進血管生成、改善局部微循環(huán)間接地保護神經(jīng)免受缺血缺氧損傷。 5、脊髓損傷后期(本實驗觀察到為4w之后)，軸突生長抑制因子nogo的高表達是影響軸突生長的重要因素，高壓氧和低壓缺氧預(yù)處理對脊髓損傷后nogo表達的影響不顯著。 6、低壓缺氧預(yù)處理可以在短期內(nèi)通過抑制P2X7受體的表達，對脊髓損傷起到神經(jīng)保護作

13、用，而高壓氧預(yù)處理則不能，是通過其他途徑起到神經(jīng)保護作用的。 三、高壓氧治療實驗性大鼠脊髓損傷的療效評價 目的：通過分組高壓氧治療，評估治療效果，為脊髓損傷的治療提供依據(jù)。 方法： 1、實驗大鼠分為四組：非預(yù)處理損傷組、非預(yù)處理損傷后高壓氧治療組、高壓氧預(yù)處理后的高壓氧治療組和低壓缺氧預(yù)處理后的高壓氧治療組，立即分別給予高壓氧治療2周。 2、觀察項目： (1)行為學(xué)評價：采用BBB運動功能

14、評分法，分別在治療后1w、2w、4w和8w進行評分。 (2)誘發(fā)電位的測定：各組大鼠分別在治療后不同時期進行體感誘發(fā)電位和運動誘發(fā)電位檢測。 (3)透射電鏡：灌注固定后取損傷區(qū)中心1mm3置入10％戊二醛液，制片，電鏡下觀察采圖。 (4)HE染色光鏡下觀察：各組大鼠分別在治療后不同時期灌注固定取材，行脊髓石蠟切片的HE染色觀察。 (5)免疫組織化學(xué)染色：觀察高壓氧治療后nestin和GFAP的表達變化。

15、 (6)神經(jīng)束路示蹤：生物素化萄聚糖胺(BDA)順行示蹤觀察下行軸突再生情況，觀察高壓氧治療對軸突再生的影響。 3、實驗內(nèi)容數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計處理。 結(jié)果： 1、經(jīng)高壓氧治療后各組在各時期與非預(yù)處理損傷組相比較，評分明顯增高，非預(yù)處理損傷組SCI后1w為2.86±1.03分，8w為14.12±2.15分，而低壓缺氧預(yù)處理后高壓氧治療組1w為5.38±1.22分，8w為18.18±1.72分

16、，差異最為明顯(p＜0.01)。 2、運動誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位的潛伏期在脊髓損傷后明顯延長，經(jīng)高壓氧治療后各組在各時期與非預(yù)處理損傷組相比較，潛伏期縮短，低壓缺氧預(yù)處理后高壓氧治療組更為明顯，差異有顯著性。 3、經(jīng)高壓氧治療后各組在各時期與非預(yù)處理損傷組相比較病理變化減輕，尤其在損傷區(qū)周圍更為明顯。 4、經(jīng)高壓氧治療后各組GFAP和nestin表達增加，2w-4w較非預(yù)處理損傷組差異顯著，低壓缺氧預(yù)處理后高壓氧