蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT)在RD細胞誘導分化中作用機制的研究.pdf

1、核小體核心組蛋白的尾部有多種共價修飾，包括乙酰化，磷酸化，甲基化和泛素化等。這些組蛋白的翻譯后修飾可以改變染色質結構，進而影響非組蛋白轉錄因子與染色質的結合，在調節(jié)轉錄過程中發(fā)揮著重要的作用。與乙?；煌瑢M蛋白甲基化的作用知之甚少，盡管這種修飾已經被發(fā)現了近40年。當初由于不清楚具體發(fā)揮甲基化作用的酶類，很難探討組蛋白甲基化與基因活化之間的直接聯系。近些年一些具有精氨酸或賴氨酸甲基化作用的酶類陸續(xù)被鑒定出來。其中蛋白質精氨酸甲基轉移

2、酶家族（proteinargininemethyltransferases，PRMTs）就是一類含有高度保守結構域的具有甲基轉移酶活性的酶類。其作用底物非常廣泛，涉及真核細胞DNA和RNA介導的許多過程。其修飾組蛋白，調節(jié)轉錄因子，調整mRNA的穩(wěn)定性，參與DNA損傷修復及裝配剪接復合體的功能是幾乎所有真核細胞功能所必需的。
　　 橫紋肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）起源于肌肉前體細胞，是一種兒童時期的軟組織肉

3、瘤，其惡性程度很高且較常見。人類胚胎型橫紋肌肉瘤衍生的RD細胞，盡管表達成肌調節(jié)因子MyoD和生肌蛋白（Myogenin），但未能完成分化。為了深入了解該腫瘤的發(fā)病機理，探索可能用于體內的治療靶點，本文以RD細胞為模型，從該腫瘤終末分化阻滯機理出發(fā)，主要研究對基因轉錄具有重要調控作用的組蛋白修飾酶--蛋白質精氨酸甲基轉移酶（PRMTs）在TPA（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）誘導RD細胞分化

4、過程中的作用及其機制，并對RD細胞分化過程中早期分化標志--生肌蛋白基因啟動子區(qū)染色質的重塑以及轉錄相關因子的結合進行研究，為橫紋肌肉瘤的臨床治療提供一定的理論依據。
　　 一、TPA誘導RD細胞分化過程中PRMT家族成員的表達情況TPA處理RD細胞過程中，流式細胞術顯示，G2/M期數值增加，細胞周期明顯阻滯；RT-PCR、WesternBlot方法檢測PRMT家族基因在RD細胞中都有不同程度的表達，且隨著RD細胞分化時間的延長

5、，表達有所增加；組蛋白精氨酸甲基化水平增加；細胞免疫熒光染色發(fā)現誘導后細胞出現分化后的形態(tài)改變，如胞體伸長，細胞內顆粒物增多；PRMT家族酶主要定位在胞漿中，細胞分化后進入細胞核。
　　 二、PRMT家族酶對TPA誘導的RD細胞分化過程中生肌蛋白基因表達的調控作用1）構建并驗證了PRMT家族各成員的有效siRNA質粒。構建并鑒定了PRMT5、PRMT6的過表達質粒pCDNA6-PRMT5（/PRMT6）-FLAG。
　　

6、 2）確定在RD細胞中，PRMT抑制劑AdOx的使用濃度為20μM。
　　 3）流式細胞術結果顯示，腺苷二醛AdOx處理的RD細胞退出細胞周期，處于G2/M期阻滯狀態(tài)。WesternBlot檢測到分化標志生肌蛋白的表達受到了明顯的抑制，說明細胞沒有進入分化過程。免疫熒光實驗結果也表明細胞形態(tài)上沒有明顯的分化趨勢。結果還顯示隨著TPA的誘導PCAF的mRNA及蛋白的表達量均明顯增加，且AdOx能明顯抑制其表達。而SWI/SNF染色

7、質重塑復合物核心亞單位Brgl不論是在TPA誘導的過程中，還是AdOx處理前后都沒有明顯的改變。啟動子活性分析實驗結果提示TPA通過某種機制激活生肌蛋白基因的表達，而可被AdOx抑制的精氨酸甲基化作用可能是其激活途徑的必經環(huán)節(jié)。以上AdOx處理細胞的實驗結果提示，精氨酸甲基化過程是細胞分化形態(tài)的改變、主要轉錄因子活化、以及成肌相關因子激活所必需的。
　　 4）應用siRNA干擾技術，經WesternBlot實驗證明，TPA誘導增

8、加的Myogenin蛋白在轉染CARM1siRNA質粒后表達受到了明顯的抑制，PCAF的表達也有所降低。且Myogenin和PCAF的入核量也都明顯減少。過表達CARM1的實驗結果顯示Myogenin、PCAF和Brg1的核內表達都明顯高于對照組。細胞免疫熒光實驗結果顯示，轉染了CARM1siRNA的細胞，在TPA誘導過程中形態(tài)上沒有明顯的分化趨勢。此外，在轉染各個PRMT特異的siRNA后，myogenin基因啟動子活性都被明顯抑制。

9、結合上述AdOx作用的相關實驗，這些結果都顯示PRMT家族酶在肌肉分化過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 5）Myogenin基因啟動子活性分析實驗結果顯示，在Brgl促進生肌蛋白表達的過程中，CARM1的作用是不可或缺的。CARM1也是PCAF增強生肌蛋白啟動子活性所必需的調控因子。而p300可能與CARM1相互作用來協同增強myogenin啟動子活性。
　　 三、PRMT家族酶對TPA誘導的RD細胞分化過程中生肌蛋白基因

10、染色質水平的調控作用1）染色質免疫共沉淀（ChIP）實驗結果表明，未經TPA誘導的對照RD細胞中，CARM1并不與生肌蛋白基因啟動子區(qū)結合，TPA誘導3小時后，CARM1開始結合到啟動子上。6小時后，結合更加明顯，而SB的處理不改變CARM1的結合，說明CARM1被募集到myogenin啟動子上是非p38依賴性的。
　　 2）未經處理的RD細胞生肌蛋白啟動子區(qū)組蛋白H3有一定水平的乙?；?，而組蛋白H4的精氨酸甲基化水平較低，TP

11、A誘導后組蛋白乙?；途彼峒谆蕉济黠@升高，且經AdOx或SB處理后都受到了抑制。
　　 3）SWI/SNF染色質重塑復合物亞基BAF60和Brgl處理前不結合在生肌蛋白啟動子上，TPA誘導后結合明顯增加，這種結合依賴于p38和精氨酸甲基化作用。
　　 4）乙?；D移酶p300在生理狀態(tài)下就結合在生肌蛋白的啟動子上，TPA誘導和SB處理后都沒有改變，但.AdOx處理明顯抑制其結合。p300/CBP協同因子--PCA

12、F只在TPA誘導后結合到啟動子上，但這種結合并不依賴于p38，而依賴于可被AdOx抑制的精氨酸甲基化作用。
　　 5）肌細胞分化調節(jié)因子MyoD不論是在TPA誘導前后，還是SB或AdOx處理過程中，都結合在啟動子上且沒有明顯的改變。PRMT5生理條件下不結合到啟動子上，TPA誘導后明顯結合，這種結合依賴于p38和精氨酸甲基化作用。
　　 6）RNA聚合酶polⅡ生理狀態(tài)下在生肌蛋白啟動子上有一定的結合，TPA誘導后結合增