人肝癌胰島素樣生長因子Ⅱ基因啟動子結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、　　人胰島素樣生長因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)是一種重要的胎兒生長因子及有絲分裂原,其基因定位于染色體11p15.5,內(nèi)含9個外顯子(E1~E9)和4個不同的啟動子(P1~P4)。E7、E8的全部和E9的第一部分編碼IGF-Ⅱ前體蛋白；E1~E6 6個外顯子為非翻譯序列,位于該基因的5′端,其中E1、E4、E5和E6之前分別有一個不同的啟動子(P1~P4),總共編碼五種5′端非翻譯區(qū)不同

2、的IGF-ⅡmRNA,但其成熟蛋白產(chǎn)物(67肽)卻相同。在生長發(fā)育過程中,4個啟動子不同的生物活性,具有組織特異性和發(fā)育階段獨立性表達特征。在胎肝和新生兒肝,IGF-ⅡmRNA表達量最高,其中P3活性最大(大約占70%),其次分別為P4及P2,P1失活；在成人肝臟,IGF-ⅡmRNA表達量顯著下調(diào),約為新生兒峰值的1/10,其中P1活性最大(約占50%),依次為P4、P2及P3,約70%成人肝臟P3呈關(guān)閉狀態(tài),僅30%成人呈微量表達。<

3、br>　　近年研究發(fā)現(xiàn),人IGF-Ⅱ在肝細胞癌變過程中呈過量表達狀態(tài),而且是癌變的早期改變事件。異常表達的IGF-Ⅱ通過自分泌和/或旁分泌生長調(diào)控機制直接作用于自身和/或鄰近肝細胞膜上的IGF-Ⅰ受體,促使細胞從G1期進入S期,加速DNA和蛋白質(zhì)等的合成,導(dǎo)致肝細胞惡性轉(zhuǎn)化。目前認為,IGF-Ⅱ的過表達與P3、P4胚胎型啟動子再活化及成人型啟動子P1失活關(guān)系密切,但P3、P4再活化和P1失活的原因及調(diào)控機制尚未完全明確。暨南大學(xué)博士學(xué)位

4、論文摘要
　　為此,本研究選擇已知IGF一11基因無異常的L一02人胎肝細胞系作為正常對照克隆該基因的P1一P4啟動子片段,并以此為基礎(chǔ),觀察肝癌中IGF一11基因啟動子堿基序列有無改變、甲基化水平變化及其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系,檢測IGF一n基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,分析啟動子的調(diào)節(jié)元件及其與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,以揭示肝癌中IGF一H基因各啟動子活性改變的可能機制及其與IGF一11過表達的關(guān)系。第一部分人工GF一n基因P1一P4啟動子

5、克隆及序列分析
　　目的：克隆人IGF一n基因Pl一P4啟動子并進行序列分析,以明確肝癌組織中工GF一11基因啟動子堿基序列有無改變及其與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的工GF一11基因DNA全序列及參考有關(guān)文獻,應(yīng)用巢式PCR技術(shù)擴增分離L一02人胎肝細胞系(正常對照)及8例肝癌組織的IGF一11基因Pl一P4啟動子片段,并采用TOPO TA Cloning kit將PCR產(chǎn)物

6、克隆入pCR2.1一TOPOT載體。目的DNA片段和陽性重組子分別通過瓊脂糖凝膠電泳及直接測序鑒定。
　　結(jié)果：①L一02細胞及8例肝癌組織P1一P4啟動子目的DNA片段均擴增成功,長度分別為942bp、684bp、1425bp及1246bp；②8例肝癌組織Pl~P4啟動子片段的堿基序列與L一02相應(yīng)的DNA序列完全相同,未見突變、缺失等改變,經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(NT』09308)相比較,結(jié)果完全一致。
　　結(jié)論：①成

7、功克隆了IGF一11基因Pl一P4啟動子；②本組肝癌組織中IGF-11基因啟動子DNA序列穩(wěn)定,未見突變、缺失等改變,可能與IGF一11異常表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制無關(guān)。第二部分人肝癌IGF一n基因Pl~P4啟動子甲基化研究目的：探討肝癌中IGF一n基因P1~P4啟動子甲基化水平變化及其對轉(zhuǎn)錄活暨南大學(xué)博士學(xué)位論文摘要性的影響。
　　方法：應(yīng)用PC尺甲基化分析法及半定量RT一PCR分別檢測肝癌細胞系(H即G2、SMMC一7721和Bel

8、一7402)、8例肝癌組織及配對的癌旁肝組織、7例正常成人肝組織中IGF一H基因Pl一P4啟動子的甲基化及其mRNA表達狀況。
　　結(jié)果：①正常成人肝組、肝癌組(包括3個肝癌細胞系,下同)和癌旁肝組Pl啟動子的甲基化率分別為14.30k(1/7)、81.8%(9/ll)和75.0%(6/8),P2啟動子的甲基化率分別為42.9%(3/7)、36.4%(4/11)和25.0%(2/6),P3啟動子的甲基化率分別為71.4ry0(5/

9、7)、0.0%和12.50k(1/8),P4啟動子的甲基化率分別為71.4%(5/7)、0.0%和0.0%。肝癌組和癌旁肝組Pl啟動子的甲基化率明顯高于正常成人肝組(P<；0.05),而P3和P4啟動子的甲基化率則都明顯低于正常成人肝組(P<；0.01,P<；0.05),P2啟動子的甲基化率在3組間無顯著性差異(P>；0.05)。②正常成人肝組、肝癌組和癌旁肝組PI mRNA的表達量分別為0.27士0.034、0.05士

10、0.028和0.09士0.040,PZ mRNA的表達量分別為0.10士0.034、0.11土0.029和0.15士0.034,P3 mRNA的表達量分別為0.04士0.027、2.20士0.427和2.99士0.654,P4 mRNA的表達量分別為0.06士0.029、0.76士0.090和1.35士0.226。肝癌組和癌旁肝組PI mRNA的表達水平均明顯低于正常成人肝組(P<；0.01),而P3和P4 mRNA的表達水平則都明

11、顯高于正常成人肝組(P<；0.01),PZ mRNA的表達水平在3組間無顯著性差異(P>；0 .05)。
　　結(jié)論：①肝癌細胞系和肝癌組織中IGF一H基因Pl、P3和P4啟動子常發(fā)生甲基化水平改變,即Pl啟動子多出現(xiàn)高甲基化,而P3和P4啟動子主要表現(xiàn)為甲基化水平降低；②IGF一H基因5‘調(diào)控區(qū)的這種異常甲基化可能與肝癌中Pl啟動子失活和P3、P4啟動子再活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制密切相關(guān)；③肝癌細胞系和肝癌組織中工GF一H基因P