桃褐腐病菌和炭疽病菌對(duì)DMI殺菌劑的抗性研究.pdf

1、Monilinia spp.和Colletotrichum spp.是危害桃樹(shù)健康生長(zhǎng)的重要病原物，分別能引起桃褐腐病和桃炭疽病。本研究以這兩類(lèi)桃樹(shù)主要病原菌為研究材料，探尋了其對(duì)包括DMI類(lèi)殺菌劑在內(nèi)的幾種主要單作用位點(diǎn)殺菌劑的抗性現(xiàn)狀和抗性機(jī)理。在我國(guó)桃褐腐病菌優(yōu)勢(shì)種Monilinia fructicola中，系統(tǒng)調(diào)查了其對(duì)4種主要?dú)⒕鷦┑拿舾谢€(xiàn)及其對(duì)DMI類(lèi)殺菌劑抗性產(chǎn)生的分子機(jī)理。并針對(duì)其抗性產(chǎn)生機(jī)理，設(shè)計(jì)了一款利用環(huán)介導(dǎo)等溫

2、擴(kuò)增（LAMP）方法進(jìn)行田間抗性菌株檢測(cè)的試劑盒。在Colletotrichum spp.中，明確了造成美國(guó)東南部桃炭疽病的病原菌，并調(diào)查了桃炭疽病菌對(duì)DMI類(lèi)殺菌劑的敏感性，同時(shí)對(duì)桃炭疽病菌中產(chǎn)生DMI抗性的分子機(jī)理進(jìn)行了探尋。研究結(jié)果為綜合防治桃褐腐病和桃炭疽病提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。所獲得具體研究結(jié)果如下:
　　(1)采集了80株來(lái)自我國(guó)5個(gè)主要產(chǎn)桃省份（市）的商用果園中的桃褐腐菌株，并測(cè)定了它們對(duì)MBC類(lèi)殺菌劑多菌靈、Q

3、oI類(lèi)嘧菌酯、DMI類(lèi)戊唑醇和SDHI類(lèi)啶酰菌胺的敏感性。其中，采自云南省的16株菌株中，15株對(duì)多菌靈產(chǎn)生了抗性。這些抗性菌株的抗性水平穩(wěn)定，不表現(xiàn)出適合度下降的現(xiàn)象，并且和乙霉威產(chǎn)生負(fù)交互抗性。離體接種試驗(yàn)表明，推薦濃度多菌靈無(wú)法有效控制抗性菌株在桃上產(chǎn)生的危害。分子水平研究表明，抗性的產(chǎn)生是由β-微管蛋白基因（TUB2）的E198A突變所致。采自福建的10株菌株中，3株具有對(duì)嘧菌酯的低等抗性。和多菌靈抗性菌株不同，這些菌株的抗性不

4、穩(wěn)定，且伴隨著適合度下降的現(xiàn)象，在靶標(biāo)基因細(xì)胞色素b(Cyt b)上，未發(fā)現(xiàn)任何點(diǎn)突變。嘧菌酯敏感菌株的抑制中濃度(EC50)為0.02到1.94μg/mL，平均值為0.54μg/mL。所有測(cè)定菌株對(duì)戊唑醇均敏感，平均EC50為0.03μg/nL。啶酰菌胺對(duì)菌株的EC50在0.01到3.85μg/mL之間，平均值為1.02μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)中國(guó)大部分地區(qū)的桃褐腐菌株而言，MBC類(lèi)、QoI類(lèi)、DMI類(lèi)和SDHI類(lèi)殺菌劑都能起到較

5、好的防效，但MBC類(lèi)殺菌劑的抗性菌株已經(jīng)出現(xiàn)。
　　(2)前期已明確65bp的Mona元件和桃褐腐病菌DMI抗性產(chǎn)生相關(guān)，本研究通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，明確了Mona具有啟動(dòng)子活性，并通過(guò)一系列刪減轉(zhuǎn)化子，將Mona的活性區(qū)域進(jìn)一步縮小為20bp。
　　(3)基于Mona元件及其側(cè)翼序列，開(kāi)發(fā)了一款利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），快速檢測(cè)田間DMI抗性桃褐腐菌株的試劑盒。利用此方法，可以特異地檢測(cè)出MfCYP51上游的Mona

6、插入，在75min內(nèi)，通過(guò)加入SYBR Green I染料，觀測(cè)結(jié)果。試驗(yàn)中利用該方法，成功檢測(cè)了51株桃褐腐菌株樣本對(duì)DMI殺菌劑的敏感性。該方法特異性強(qiáng)，專(zhuān)化性高，不會(huì)誤檢出其它6種桃樹(shù)上常見(jiàn)病原菌。同時(shí)，該方法靈敏度高，可以檢測(cè)到10fg的DNA模板，比普通PCR方法靈敏100倍。試驗(yàn)還開(kāi)發(fā)了直接以菌絲為模板，檢測(cè)其抗性是否產(chǎn)生的方法。由于LAMP方法具備結(jié)果可靠、操作簡(jiǎn)便、不需實(shí)驗(yàn)室昂貴儀器等特點(diǎn)，適于DMI抗性菌株的田間檢測(cè)。

7、
　　(4)就桃炭疽病菌而言，試驗(yàn)從美國(guó)南卡羅來(lái)那州和佐治亞州的商用桃園中采集了Colletotrichum acutatum復(fù)合種菌株，整合分析其ITS、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)、β-微管蛋白（TUB2）基因序列，將這些復(fù)合種菌株細(xì)分成了Colletotrichum nymphaeae和Colletotrichum fioriniae2個(gè)種。接著調(diào)查了這2個(gè)種，及另外3個(gè)采集自美國(guó)東南部的桃炭疽種（Colletotr

8、ichum fructicola，Colletotrichumsiamense和Colletotrichum truncatum），對(duì)包括苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、葉菌唑、粉唑醇和腈苯唑在內(nèi)6種DMI類(lèi)殺菌劑的敏感性。結(jié)果表明，C.truncatum對(duì)戊唑醇、葉菌唑、粉唑醇和腈苯唑產(chǎn)生了抗性，C.nymphaeae對(duì)粉唑醇和腈苯唑產(chǎn)生了抗性。C.fructicola和C.siamense對(duì)所有的6種DMI類(lèi)殺菌劑都敏感(EC50值分別

9、為0.2到13.1μg/mL)。C.fioriniae中的一個(gè)分支（命名為C.fioriniae亞群2）整體上比另一個(gè)分支（命名為C.fioriniae亞群1）對(duì)以上殺菌劑較為不敏感，其EC50值分別為0.5到16.2μg/mL，及0.03到2.1μg/mL。對(duì)所有測(cè)定的5個(gè)種而言，苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑都具有最好的防效(EC50值為0.2-2.7μ.g/mL)，戊唑醇和葉菌唑?qū)Τ薈.truncatum以外的其它種有較好的防效。試驗(yàn)表明，