中黑盲蝽信息素合成相關(guān)基因的篩選及功能分析.pdf

1、信息素是昆蟲化學交流的重要媒介物質(zhì)，對物種的生存和發(fā)展具有重要的意義。近幾十年來，解密其功能，生物合成路徑、分子機制以及演化過程，引起了人們極大的興趣。目前，鱗翅目昆蟲信息素的生物合成分子機制已逐漸清晰，鞘翅目以及雙翅目昆蟲信息素的生物合成路徑也有一定的研究。相比之下，在半翅目昆蟲中，其信息素的生物合成分子機制尚未見報道。本研究以棉花上的重要害蟲中黑盲蝽為研究對象，構(gòu)建了中黑盲蝽后胸臭腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選了不同實驗條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基

2、因，利用RNA-Seq技術(shù)獲得了在信息素釋放高峰期雌蟲后胸臭腺內(nèi)高表達的差異基因，最后結(jié)合實時定量PCR(RT-qPCR)和RNA干擾(RNAi)首次對中黑盲蝽信息素合成相關(guān)基因進行篩選和功能分析。主要結(jié)論如下:
　　1.中黑盲蝽后胸臭腺轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)庫構(gòu)建
　　中黑盲蝽Adelphocoris suturalis為非模式昆蟲，其基因組資源的缺乏限制了對其各種生理生化過程分子機制的研究。本研究通過對中黑盲蝽后胸臭腺

3、進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得了52，067，950條長度為91 bp的Clean Reads，進一步組裝成70，296條Unigenes，其中26，744(38％)條Unigenes能夠有效的匹配(E-value＜10-5) NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白。有9，258個注釋序列通過同源基因聚類分析(COG)歸屬于25個不同的生物學功能。16，473條Unigenes分別歸類于242個KEGG代謝路徑。通過生物信息學分析，篩選出了818條的信息素

4、合成相關(guān)候選基因。該結(jié)果為探索中黑盲蝽信息素合成的分子機制提供了基礎(chǔ)分子資源。
　　2.中黑盲蝽實時定量PCR內(nèi)參基因的篩選
　　在利用RT-qPCR技術(shù)分析基因的表達過程中，選擇合適的內(nèi)參基因來均一化不同樣品之間的差異是最基本的要求。然而，目前沒有文獻對中黑盲蝽內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行描述。本章節(jié)評價了12個半翅目昆蟲常用的內(nèi)參基因(GAPDH、ACT、βACT、TBP、SDH、βTUB、EF1γ、EF1α、EF1d、RPL3

5、2、RPS15和RPL27)在不同的實驗條件下的表達穩(wěn)定性。BestKeeper、geNorm、NormFinder、ΔCt和RefFinder被用于計算各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值。結(jié)果推薦EF1γ、 EF1d和RPS15作為中黑盲蝽各生理過程基因表達分析最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　3.RNA-Seq和RNAi篩選中黑盲蝽信息素合成相關(guān)基因
　　以前期構(gòu)建的中黑盲蝽后胸臭腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了4個中黑盲蝽

6、不同發(fā)育階段和性別后胸臭腺即1日齡雌蟲后胸臭腺(1d FMTG)、1日齡雄蟲后胸臭腺(1d MMTG)、8-11日齡雌蟲后胸臭腺(8-11d FMTG)和8-11日齡雄蟲后胸臭腺(8-11d MMTG)的表達文庫，均獲得了超過6.9×10-6的CleanReads。差異比較分析結(jié)果顯示，在不同發(fā)育階段及性別的臭腺之間差異表達的基因數(shù)目在3，350-12，834之間。RT-qPCR驗證結(jié)果顯示DesB、AOX、 FAR和一些ATF均在雌蟲

7、性信息素釋放高峰期的后胸臭腺內(nèi)高表達。因此，選擇了DesB、AOX、 FAR以及ATF中差異表達最顯著的N-ATF10作為候選基因進行下一步的RNAi實驗，以驗證其是否參與了中黑盲蝽信息素的生物合成。結(jié)果表明只有沉默DesB基因的表達顯著抑制了雌蟲對雄蟲的引誘能力，這可能預示著DesB與中黑盲蝽信息素的生物合成相關(guān)。
　　4.基于RNAi的DesB基因功能驗證
　　在許多昆蟲中，Desaturases是催化信息素組分雙鍵形成

8、的關(guān)鍵酶類。前期的研究結(jié)果表明，沉默DesB基因的表達顯著抑制了雌蟲對雄蟲的引誘能力，因此我們推測DesB可能參與了中黑盲蝽的信息素合成。為了驗證這一假設(shè)，從中黑盲蝽中分離鑒定出了兩個DesaturasesB基因全長序列，并命名為Desaturase B1(DesB1)和Desaturase B2(DesB2)。序列分析結(jié)果顯示，DesB1和DesB2享有共同的開放閱讀框，其序列差異僅在5端非編碼區(qū)。Southern blot分析結(jié)果表

9、明，DesB1和DesB2屬于兩個獨立的基因。組織表達分析結(jié)果顯示，在所有的五個測試組織中，DesB2的轉(zhuǎn)錄豐度均顯著高于DesB1，尤其是在后胸臭腺中。室內(nèi)Y型嗅覺儀以及田間誘捕實驗進一步驗證了DesB基因表達的下調(diào)顯著抑制了雌蟲性引誘能力。通過GC-MS分析DesB基因表達的下調(diào)對中黑盲蝽信息素滴度的影響，結(jié)果顯示抑制DesB基因的表達，顯著增加了中黑盲蝽信息素組分之一4-氧代-反-2-己烯醛的含量，改變了性信息素組分的混合配比。<

10、br>　　5.中黑盲蝽的卵巢發(fā)育及繁殖能力的必須基因——FAR
　　在許多昆蟲中（例如，鱗翅目和雙翅目），F(xiàn)atty acyl-CoA reductase(FAR)是催化信息素含氧官能團形成的關(guān)鍵酶類。在本章中克隆獲得了一個中黑盲蝽的FAR基因全長序列。時空表達模式分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AR在中黑盲蝽的卵巢內(nèi)高表達，并且隨著卵巢的發(fā)育呈上升的趨勢。RNAi驗證結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)AR基因的表達顯著減少了中黑盲蝽卵母細胞的數(shù)量和卵巢的干重，抑