WWOX基因在卵巢癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、背景：卵巢癌是最嚴(yán)重的女性生殖道惡性腫瘤之一，易于盆腹腔廣泛播散轉(zhuǎn)移的腫瘤，就診時(shí)70％的病例已屬晚期。在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌死亡率最高。大量資料表明，浸潤轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，受多種因素、多基因的調(diào)控。 粘附是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素。在腫瘤侵襲過程中，腫瘤細(xì)胞首先通過膜表面受體粘附于基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的成分，然后以蛋白酶降解基底膜和基質(zhì)，最后定向運(yùn)動(dòng)穿過基底膜和基質(zhì)。整合素是一類介導(dǎo)細(xì)胞

2、與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的細(xì)胞表面受體家族，由α及β兩個(gè)亞單位組成。整合素最基本的粘附功能決定了它在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起了不可替代的作用。 WWOX是最近克隆的抑癌基因，它位于染色體16q23.3-24.1區(qū)域，并跨越了整個(gè)常見染色體脆性位點(diǎn)FRAl6D，常有雜合性及純合性掉失。WWOX表達(dá)的改變常見于乳腺、前列腺、卵巢、肺、胃等部位的腫瘤。位于常見染色體脆性位點(diǎn)的DNA不穩(wěn)定性通常與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，WWOX基因與常見染色體脆性位點(diǎn)FR

3、A3B的FHIT基因非常相象，故被認(rèn)為是繼FHIT基因之后的又一個(gè)新的抑癌基因。有研究WWOX表達(dá)缺失在卵巢癌中常見的，卵巢腫瘤盆腹腔粘連，可能與ECM粘附有關(guān)，而ECM粘附的上調(diào)與WWOX缺失、無功能有關(guān)，通過WWOX轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)其粘附性。為了探索WWOX可能與ECM問的相互作用，將wWOX轉(zhuǎn)入卵巢癌上皮細(xì)胞株，研究轉(zhuǎn)基因前后細(xì)胞生物特性變化，闡述WWOX在卵巢癌浸潤轉(zhuǎn)移的作用。 方法： 1．采用PT-PCR方法檢測H

4、ctll6/4 coildtype(野生型)、Hctll6 p53 null(p53<'->)、Hctll6 p2l null(p21<'->)、Hctll6 Bax null(Bax<'->)細(xì)胞株的WWOX基因表達(dá)。從瓊脂糖凝膠中分離和提取DNA，進(jìn)行DNA純化，測序，測序結(jié)果與GeneBank上公布序列AF211943進(jìn)行比較，以了解WWOX的改變對(duì)腫瘤發(fā)生的影響。 2．采取RT-PCR法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染wWOX細(xì)胞株(H細(xì)胞

5、株)及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞株(F細(xì)胞株)的WWOX基因表達(dá)，Western Blot檢測WWOX蛋白的表達(dá)，同時(shí)，檢測整合素的變化。 3．將已構(gòu)建攜帶有表達(dá)WWOX基因和對(duì)照質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取及純化、無菌處理后，質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PEO1卵巢癌細(xì)胞，得到攜帶有目的基因的細(xì)胞株。WesternBlot檢測到WWOX蛋白表達(dá)，以及整合素的變化情況。 4．對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的WWOX及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的PEOl細(xì)胞株進(jìn)行Matrix粘附試

6、驗(yàn)，細(xì)胞株在Fn包被的培養(yǎng)孔培養(yǎng)，檢測Fn介導(dǎo)的粘附性。 5．采用α、β整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，初步篩選出與卵巢上皮癌有關(guān)的α、β整合素。利用篩選出與卵巢上皮癌有關(guān)的α、β整合素抗體，進(jìn)行封閉卵巢癌細(xì)胞株細(xì)胞表面的整合素抗原試驗(yàn)、FACS試驗(yàn)及Mesothelial試驗(yàn)作進(jìn)一步驗(yàn)證。 6．采用RNAi干擾技術(shù)，50nM siRNA WWOX經(jīng)Lipofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后96小時(shí)，Matri

7、x粘附試驗(yàn)檢測Fn介導(dǎo)的細(xì)胞粘附性，Western Blot檢測WWOX基因沉默情況，了解WWOX基因沉默對(duì)細(xì)胞侵襲粘附能力的影響。 7．Caspase-Glo<'TM> 3/7檢測WWOX基因沉默后，DDP對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1．測序結(jié)果顯示，第一對(duì)引物9F1與9R1，在T1497G有雜合子性丟失，證實(shí)細(xì)胞株有二種類型的WWOX表達(dá)，全長的WWOX。mRNA的轉(zhuǎn)錄，和外顯子6～8丟失的WWOX mR

8、NA的異常轉(zhuǎn)錄。第二對(duì)引物8F1與9R2，僅表達(dá)全長的WWOX mRNA染色體才有PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物在T1497G為G。第三對(duì)引物5Fl與9R3，擴(kuò)增產(chǎn)物為929bp和389bp。在389bp的T1497G，只有T，來自于WWOX mRNA的異常轉(zhuǎn)錄的染色體。 2．RT-PCR結(jié)果顯示，H細(xì)胞株及F細(xì)胞株均有外顯子9的mRNA WWOX的表達(dá)。Westem Blot也顯示在H細(xì)胞株有WWOX蛋白的表達(dá)，F(xiàn)細(xì)胞株無WWOX表達(dá)。W

9、estern Blot結(jié)果顯示，F(xiàn)細(xì)胞株的α2及β1蛋白表達(dá)明顯高于H細(xì)胞株p<0.05)。 3．Matrix粘附試驗(yàn)顯示，細(xì)胞株在Fn包被的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)2h后，母細(xì)胞株P(guān)EO1及F細(xì)胞株對(duì)Fn介導(dǎo)細(xì)胞的粘附明顯高于H細(xì)胞株p<0.01)，而培養(yǎng)30min、lh、24h有降低，但無顯著性意義(p>0.05)。＃4．Western Blot也顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX的PEOl細(xì)胞株，WWOX表達(dá)量在72h后最高，146小時(shí)后逐漸消失

10、。隨著wWOX蛋白的表達(dá)增加，能下調(diào)Fn介導(dǎo)整合素β1的表達(dá)。但α2的表達(dá)則相反，隨著WWOX蛋白的表達(dá)增加而增加。 5．α整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)提示，F(xiàn)細(xì)胞株的α2及α3整合素的表達(dá)高于H細(xì)胞株的表達(dá)(P<0.05)。 6．β整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)提示，F(xiàn)細(xì)胞株β1整合素的表達(dá)明顯高于H細(xì)胞株的表達(dá)p<0.05)。 7．封閉α整合素的粘附試驗(yàn)結(jié)果也提示，封閉α2、α3整合素，與加入IgG的對(duì)照組相比，細(xì)胞株

11、在Fn包被的培養(yǎng)孔生長的細(xì)胞數(shù)目減少。封閉α3后，F(xiàn)細(xì)胞株的粘附細(xì)胞數(shù)比H細(xì)胞株明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)。封閉α2后，F(xiàn)細(xì)胞株的粘附細(xì)胞數(shù)與H細(xì)胞株的相比較，差異無顯著性(p>0.05)。8．封閉β整合素的粘附試驗(yàn)結(jié)果也提示，封閉β1或β2，與加入IgG的對(duì)照組相比，細(xì)胞株在Fn包被的培養(yǎng)孔生長的細(xì)胞數(shù)目減少。封閉βl后，F(xiàn)細(xì)胞株的粘附細(xì)胞數(shù)比H細(xì)胞株明顯減少，差異有顯著性(p<0.05)。封閉β2后，F(xiàn)細(xì)胞株的粘附細(xì)胞數(shù)

12、與H細(xì)胞株的相比較，差異無顯著性(P>0.05)。 9．FACS檢測細(xì)胞表面整合素的結(jié)果顯示，F(xiàn)細(xì)胞株的α3表達(dá)高于H細(xì)胞株(P<0.05)，但α2表達(dá)在F細(xì)胞株與H細(xì)胞株，無明顯差異(P>0.05)。 10．Matrix粘附試驗(yàn)顯示，WWOX沉默后的細(xì)胞株比對(duì)照組(mock，non targeting，untreated)對(duì)Fn介導(dǎo)的粘附性明顯增加(p<0.05)。Western Blot也顯示，WWOX沉默后WWOX

13、蛋白表達(dá)明顯受到抑制，而對(duì)照組的WWOX蛋白表達(dá)沒有改變(p<0.05)。11.Caspase-Glo<'TM>3/7檢測顯示，在WWOX基因沉默后的細(xì)胞株及對(duì)照組(non targeting，untreated)相比，DDP對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．HCTll6細(xì)胞株有二種類型的WWOX表達(dá)，全長的WWOX mRNA的轉(zhuǎn)錄，和外顯子6～8丟失的WWOX．mRNA的異常轉(zhuǎn)錄，這二種轉(zhuǎn)錄來自兩

14、個(gè)不同的等位基因。 2．H細(xì)胞株為WWOX基因已整合在PEO1細(xì)胞的基因組，能穩(wěn)定傳代。F細(xì)胞株是空質(zhì)粒整合在PEO1細(xì)胞的基因組，并能穩(wěn)定傳代。WWOX能下調(diào)α2、α3及β1整合素的表達(dá)，降低細(xì)胞的粘附性。同樣，WWOX能降低細(xì)胞對(duì)Fn介導(dǎo)的粘附性，說明wwox抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。 3．瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX也進(jìn)一步證實(shí)WWOX能下調(diào)Fn介導(dǎo)的整合素β1的表達(dá)，降低其粘附性。 4．WWOX沉默后試驗(yàn)，進(jìn)一步說明