小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā).pdf

1、小反芻獸疫病毒(PPRV)是能夠感染羊等小反芻動(dòng)物的烈性傳染病病源。N蛋白為PPRV的核蛋白，具有較好的免疫原性。本研究構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N，純化了PPRV原核表達(dá)蛋白，制備了抗PPRVN蛋白的單克隆抗體，構(gòu)建了表達(dá)PPRVN蛋白的Bac-PPRV-N，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)PPRV抗體的阻斷ELISA方法，為PPRV的臨床診斷提供有效的工具。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.PPRV N蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

2、　　利用原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了PPRV的N蛋白。將純化的蛋白免疫小鼠，通過細(xì)胞融合及亞克隆，篩選出了六株可穩(wěn)定分泌抗PPRV N蛋白的單克隆抗體，分別命名為:1H5、2H5、1A7、1G5、1A6和2F5。經(jīng)鑒定，篩選到的六株單抗均為IgG，其亞型均為IgG2b，輕鏈均為Kappa鏈。通過IFA和Western Blot分析，所制備的六株單抗均能夠特異性識(shí)別PPRVN蛋白。通過將N基因截短表達(dá)，經(jīng)Western Blot檢測(cè)，單抗1H5、

3、2H5、1G5、2F5識(shí)別的抗原表位位于N基因的112aa-144aa的氨基酸區(qū)域;單抗1A7、1A6識(shí)別的抗原表位位于N基因的144aa-240aa的氨基酸區(qū)域。利用PPRV陽性參考血清、陰性參考血清對(duì)所篩選的抗體進(jìn)行了阻斷活性的檢測(cè)，驗(yàn)證了篩選的單抗1H5、2H5、1A7、1G5、1A6和2F5的阻斷率分別為79.28％、71.74％、93.32％、84.29％、73.82％、74.49％。
　　2.PPRV N蛋白桿狀病毒表

4、達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)里利用pFastBac HTB載體構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒Bac-PPRV-N。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，拯救重組桿狀病毒Bac-PPRV-N。通過IFA和WesternBlot分析，Bac-PPRV-N重組桿狀病毒表達(dá)的PPRV N蛋白能夠與N蛋白的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　3.PPRV阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)
　　將親和層析純化的原核表達(dá)N蛋白作為包被抗原，具有阻斷活

5、性的單抗1A7進(jìn)行HRP標(biāo)記作為酶標(biāo)二抗，通過優(yōu)化各個(gè)反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)PPRV抗體的阻斷ELISA方法。通過與法國ID.VET公司生產(chǎn)的PPRV抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，共檢測(cè)臨床血清樣品262份，其總符合率為94.2％。與青島瑞爾生物有限公司生產(chǎn)PPRV阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，共檢測(cè)臨床血清樣品241份，其總符合率為97.9％。批間重復(fù)試驗(yàn)與批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的驗(yàn)證中，該試劑盒的變異系數(shù)在10％以內(nèi)，說明，該試劑盒重復(fù)性良好