山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的克隆及轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、低溫是經(jīng)常發(fā)生且危害嚴(yán)重的逆境因素之一，許多果樹在經(jīng)受低溫脅迫后都發(fā)生不同程度的傷害，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致整個植株死亡。近年來在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的CBF(CRT/DREbindingfactor)低溫反應(yīng)途徑，使當(dāng)前果樹抗寒分子生物學(xué)與基因工程研究取得了重大突破。CBF轉(zhuǎn)錄激活因子可與COR(cold-regulated)基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsiveelement)調(diào)控元件特

2、異結(jié)合，并作為COR蛋白表達(dá)的開關(guān)，誘導(dǎo)一系列COR蛋白的表達(dá)，從而提高植物的抗凍力。本文對山葡萄低溫誘導(dǎo)基因CBF1進(jìn)行了克隆與序列分析；構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的植物表達(dá)載體，并建立了山葡萄再生體系，研究了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因在煙草和山葡萄中的表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下： 1.通過將GenBank上發(fā)表的幾種植物的CBF1同源基因進(jìn)行比較在其保守區(qū)域設(shè)計一對兼并引物，采用RT-PCR方法對山葡萄低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子

3、CBF1基因中間片段進(jìn)行克隆，得到一大小為758bp的片段，并在此中間片段區(qū)域設(shè)計了兩對特異引物，采用反向PCR方法對山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的5′和3′端的非編碼區(qū)進(jìn)行克隆，結(jié)果得到一長度為752bp的片段，與中間片段合并得到一大小為910bp的片段，此為預(yù)測的全長。在預(yù)測的全長區(qū)域的非編碼區(qū)和編碼區(qū)內(nèi)分別設(shè)計兩對特異引物對山葡萄基因組和cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，測序結(jié)果得到的兩序列在編碼區(qū)內(nèi)完全一致，這也說明了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因在

4、編碼區(qū)沒有內(nèi)含子出現(xiàn)。應(yīng)用DNAman軟件將山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因全長與Genebank上發(fā)表的幾種植物CBF1基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1和葡萄(Vitisvinifera)CBF1基因的氨基酸同源性為98.1﹪；核苷酸的同源性為97.6﹪，這說明我們已經(jīng)成功地克隆了山葡萄(VitisAmurensis)轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因，在GenBank上的登記號為DQ517296。 2.利用35s

5、啟動子構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的植物表達(dá)載體。應(yīng)用XbaⅠ和SacⅠ將質(zhì)粒pBI121中的GUS基因切除，設(shè)計一對含有XbaⅠ和SacⅠ酶切位點的特異引物PZ1、PZ2，對山葡萄cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物酶切后插入到質(zhì)粒pBI121中的GUS基因切除部位，獲得山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因的植物表達(dá)載體pBC35S，進(jìn)一步采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草和山葡萄，對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明山葡萄轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因轉(zhuǎn)化煙草的成

6、功率很高，達(dá)到了94﹪，但對山葡萄進(jìn)行轉(zhuǎn)化卻未得到轉(zhuǎn)基因植株，這個問題還有待進(jìn)一步研究。 3.對山葡萄再生體系進(jìn)行了研究：采用當(dāng)年生的山葡萄幼嫩枝條，無菌處理后，選用合適的激素濃度進(jìn)行組織培養(yǎng)和快繁。獲得了大量的山葡萄試管苗，進(jìn)一步用此無菌試管苗，采用不同濃度梯度的BA和IBA激素濃度進(jìn)行再生體系的研究，結(jié)果用莖段采用激素濃度BA2.0mg/l和IBA0.02-0.05mg/l獲得了山葡萄再生芽，選用合適的激素濃度進(jìn)行生根培養(yǎng)，