利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Lon基因表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、背景與目的: Lon是高度保守的ATP依賴蛋白酶，近期研究發(fā)現(xiàn)作為線粒體蛋白，它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本文將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Lon基因表達(dá)下調(diào)，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡，以探討Lon蛋白在真核細(xì)胞中的功能。 方法: 應(yīng)用RT-PCR方法觀察乳腺癌細(xì)胞MCF7、肺癌細(xì)胞NCI-H23等8種腫瘤細(xì)胞系和一種正常成纖維細(xì)胞系COS7細(xì)胞中Lon基因的表達(dá)情況。我們選用表達(dá)較為豐富的MCF7細(xì)胞株作為研究的靶細(xì)胞，設(shè)計(jì)針對(duì)Lon

2、蛋白酶的小干擾RNA(siRNA)，構(gòu)建pSilencer U6 2.1-Lon真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。并經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)Lon表達(dá)水平的變化；細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力；采用高溫、紫外線照射、順鉑處理來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，用噻唑藍(lán)法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

3、siRNA誘導(dǎo)后的細(xì)胞周期和凋亡率。Caspase-3活性檢測(cè)Lon下調(diào)介導(dǎo)的凋亡途徑。 結(jié)果: Lon基因在8種腫瘤細(xì)胞系以及正常細(xì)胞系中均有表達(dá)。RT-PCR和Western blot顯示重組質(zhì)粒pSilencer U6 2.1-Lon轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞，Lon mRNA和蛋白水平均明顯降低；同時(shí)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞大量增加；細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖能力明顯減弱。紫外線照射和順鉑處理后的MTT結(jié)果顯示pSilencer

4、U6 2.1-Lon轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，增殖能力明顯下降，與空載體轉(zhuǎn)染組相比有顯著性差異(P<0.05)，空載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。加熱應(yīng)激試驗(yàn)顯示，41℃處理后，RNA干擾轉(zhuǎn)染組(pSilencer U6 2.1-Lon)與空載體轉(zhuǎn)染組(pSilencer U6 2.1)相比有顯著性差異(P<0.05)；而在43℃、45℃，pSilencer U6 2.1-Lon轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組之間無(wú)顯著性差異(

5、P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在細(xì)胞周期中，pSilencer U6 2.1-Lon組的細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞增多，同時(shí)S期的細(xì)胞比例減少，而另兩組細(xì)胞無(wú)此改變；細(xì)胞凋亡率pSilencer U6 2.1-Lon質(zhì)粒組為22.47％±3.15％，與空載體轉(zhuǎn)染組2.3％±0.9％和無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組1.14％±0.79％比較有明顯提高，而空載體轉(zhuǎn)染組和無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異；經(jīng)順鉑處理后pSilencer U6 2.1-Lon質(zhì)粒組的凋