蒺藜皂苷對β-淀粉樣肽（25-35）所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其機制.pdf

1、目的：作為老年性癡呆的主要類型，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙、人格改變等，常發(fā)生于老年和老年前期。主要病理特征為大腦萎縮、腦組織內(nèi)出現(xiàn)老年斑(senile plaque,SP)、腦血管沉淀物、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)和神經(jīng)元的丟失。隨著人類平均壽命的延長，世界人口老齡化的加快，AD的發(fā)病率也

2、在增加。在發(fā)達(dá)國家，AD己成為繼心臟病、癌癥、腦卒中之后第4位的致死性疾病。但由于其病因及發(fā)病機制不清，目前尚缺乏肯定有效的治療手段。研究AD的病因及發(fā)病機制，尋找有效的預(yù)防和治療AD的藥物，已成為世界醫(yī)學(xué)界的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)細(xì)胞外沉積的凝聚態(tài)的β淀粉樣肽(β-amyloid peptide,Aβ)是老年斑的一種重要組成成分，β淀粉樣肽是由40～42個氨基酸組成的肽鏈，具有神經(jīng)毒性，可引起動物學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知功能障礙，還

3、可出現(xiàn)神經(jīng)退化和死亡。而且研究發(fā)現(xiàn)Aβ中第25～35這11個氨基酸組成的肽鏈Aβ25-35的凝聚態(tài)比溶解態(tài)具有更強的神經(jīng)毒性。 蒺藜為蒺藜科(Zygophylaccac)蒺藜屬(Tribulus)植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)的干燥成熟果實，具有平肝解郁、明目、止癢等功效。蒺藜皂苷(Gross saponin from Tribulusterrestris L.，GSTT)是蒺藜果實中提取的甾體皂苷的總

4、稱，現(xiàn)代研究證明，蒺藜皂苷具有治療心腦血管疾病、增強性功能、清除自由基等作用，同時有研究表明蒺藜皂苷對D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型的體重減輕、脾臟及胸腺萎縮有抑制作用，并可降低其膽固醇及血糖水平，延長小鼠的游泳時間。蒺藜皂苷對Aβ25-35所導(dǎo)致阿爾茨海默病是否有保護(hù)作用目前尚未見報道。本實驗擬采用小鼠側(cè)腦室一次性注射β淀粉樣肽(β-amyloid peptide,Aβ25-35)3nmol誘發(fā)Aβ25-35在腦內(nèi)的沉積，造成AD

5、小鼠模型。采用Morris水迷宮和程控避暗箱實驗考察小鼠空間辨別能力和學(xué)習(xí)記憶能力，通過測定小鼠腦組織過氧化氫(hydrogen dioxide,H2O2)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)和一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)等生化指標(biāo)，觀察小鼠腦組織病理學(xué)變化，從

6、而研究蒺藜皂苷對Aβ25-35所致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其可能機制。 方法：昆明種♂小鼠75只，隨機為5組，分別為生理鹽水對照組(正常對照組，control group)；β-淀粉樣肽(模型組,model group)；GSTT各治療組(GSTT group)： GSTT 50mg.kg-1組、GSTT 150mg·kg-1組和GSTT 450mg·kg-1組。模型組和GSTT各治療組于小鼠右側(cè)腦室一次性注射A β25

7、-353.0μ L(3nmol)，正常對照組注入等量生理鹽水。于造模后1h給藥，GSTT各治療組腹腔注射(ip)相應(yīng)劑量的GSTT(0.1mL·10g-1)；正常對照組及模型組ip 0.1mL·10g-1生理鹽水(NS)，每天1次，共14d。 d8～d13進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)實驗，觀察蒺藜皂苷對小鼠側(cè)腦室注射A β 25-35所造成的學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用。行為學(xué)實驗均在上午8:30分開始。d8給藥后1h進(jìn)行避暗實驗訓(xùn)練，24h后

8、以同樣的方法進(jìn)行測試，記錄動物進(jìn)入暗室的潛伏期以及3min內(nèi)錯誤次數(shù)。d10給藥后1h開始水迷宮實驗，每只動物每天訓(xùn)練四次，每次從不同的象限入水，每次訓(xùn)練120s，連續(xù)訓(xùn)練4d，記錄小鼠尋找站臺的潛伏期、120s內(nèi)游泳路徑的長度及尋找平臺所采取的策略(包括隨機式、邊緣式、趨向式和直線式)。 d14給藥后1h將小鼠迅速斷頭處死，取腦，制成1O％腦勻漿，然后將制備好的腦勻漿以3000r.min-1離心10min，取上清液適量，按照試

9、劑盒說明書分別測定過氧化氫(H2O2)的含量、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力，一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力，采用考馬斯亮蘭法測定腦組織蛋白含量。 另取昆明種♂小鼠50只，隨機為5組，分組、造模、給藥同前，d14給藥后1h將小鼠快速斷頭取腦，采用常規(guī)HE染色及鈾.鉛染色并制備切片，分別在光鏡和電鏡下觀察小鼠海馬、皮質(zhì)區(qū)的病理變化。 結(jié)果：

10、 1避暗實驗中，蒺藜皂苷對Aβ25-35所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響結(jié)果顯示：一次性側(cè)腦室注射Aβ25-35可造成小鼠記憶障礙，模型組與正常對照組相比較小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加，且均有顯著性差異(P＜0.01)；蒺藜皂苷(50，150,450mg.kg-1)可不同程度的對抗Aβ25-35所致小鼠記憶障礙。 2 Morris水迷宮實驗中，蒺藜皂苷對Aβ25-35所致小鼠探索行為障礙的影響結(jié)果顯示：Aβ25-35造成了小鼠

11、空間學(xué)習(xí)記憶能力的障礙，模型組與正常對照組相比潛伏期、游泳路徑顯著延長；而蒺藜皂苷各治療組均可不同程度地改善Aβ25-35所致空間學(xué)習(xí)記憶障礙。在訓(xùn)練開始的d1和d2，各組小鼠主要以邊緣式和隨機式策略尋找站臺，隨著訓(xùn)練次數(shù)的逐漸增加，邊緣式和隨機式搜索策略逐漸減少，趨向式和直線式搜索策略出現(xiàn)率逐漸增加，正常對照組和蒺藜皂苷各治療組邊緣式和隨機式下降的速度和程度較模型組快，趨向式和直線式出現(xiàn)的速度和程度較模型組快。 3蒺藜皂苷對A

12、β25-35所致小鼠腦組織內(nèi)各種生化指標(biāo)的影響3.1蒺藜皂苷對Aβ25-35所致小鼠腦組織H2O2含量、CAT和GSH-Px活力的影響結(jié)果顯示：側(cè)腦室注射Aβ25-353μL后可引起小鼠腦組織內(nèi)H2O2含量增加，同時使小鼠腦組織內(nèi)CAT和GSH-Px活力顯著降低，而連續(xù)ip蒺藜皂苷14d治療后，與模型組相比蒺藜皂苷50mg.kg-1降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性無顯著性差異(P＞0.05)。蒺藜皂苷150mg.kg-1治

13、療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，蒺藜皂苷450mg.kg-1治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01)。 3.2蒺藜皂苷對Aβ25-35所致小鼠腦組織NO含量、NOS和iNOS活力的影響結(jié)果表明，側(cè)腦室注射Aβ25-353μL后可引起小鼠腦組織內(nèi)NO含量增加，同時使小鼠腦組織內(nèi)NOS和iNOS活性顯著升高，而連續(xù)ip蒺藜皂苷14d治療后，蒺藜皂苷50mg

14、·kg-1治療組可顯著降低NO含量和NOS、iNOS的活性(P＜0.05)，而蒺藜皂苷150mg·kg-1和450mg·kg-1治療組均可顯著降低NO含量和NOS、iNOS的活性(P＜0.01)。 4蒺藜皂苷對Aβ25-35所致小鼠腦組織神經(jīng)病理形態(tài)的影響4.1光鏡觀察結(jié)果顯示：正常對照組海馬CAl區(qū)神經(jīng)元密集、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常：模型組神經(jīng)元間隙加大，說明有輕度水腫，部分神經(jīng)元核、質(zhì)界限模糊，細(xì)胞嗜酸性增強；蒺藜皂苷各治療組可不同

15、程度減輕上述病理學(xué)改變。 4.2電鏡觀察結(jié)果顯示：正常對照組神經(jīng)元、神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)正常；模型組神經(jīng)元輕度水腫，脂褐素樣包含物增多，線粒體減少或消失；蒺藜皂苷各治療組可不同程度的減輕上述病理學(xué)改變。 結(jié)論： 1側(cè)腦室注射Aβ25-35可造成小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，引起小鼠腦內(nèi)過氧化氫(H2O2)含量升高、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力降低，同時導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)NO含量升高，NOS和iNOS活力

16、顯著升高，并可引起腦組織的神經(jīng)病理形態(tài)改變，出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡等異?，F(xiàn)象。 2蒺藜皂苷(150,450mg·kg-1)能明顯改善Aβ25-35造成的學(xué)習(xí)記憶障礙，而蒺藜皂苷(50mg·kg-1)能改善Aβ25-35造成的學(xué)習(xí)記憶障礙；蒺藜皂苷(150,450mg·kg-1)能顯著降低小鼠腦內(nèi)過氧化氫(H2O2)含量、并顯著提高小鼠腦內(nèi)過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力，而蒺藜皂苷(50mg-kg-1)能降

17、低小鼠腦內(nèi)過氧化氫(H2O2)含量、并提高小鼠腦內(nèi)過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力；蒺藜皂苷(50,150,450mg·kg-1)能顯著降低NO含量以及NOS和iNOS活力。 3蒺藜皂苷(50，150,450mg·kg-1)對Aβ25-35所導(dǎo)致的腦組織神經(jīng)病理形態(tài)異常有不同程度的對抗作用。 蒺藜皂苷改善Aβ25-35造成小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作用機制可能為：提高機體清除自由基能力、減少自由基的產(chǎn)生；通過