人參水提果膠的結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞壁中的分布.pdf

1、人參(Panax ginseng C.A.Meyer)作為名貴中藥在我國(guó)已有4000多年的應(yīng)用歷史。人參中含有多種有效成分，如人參皂甙、多肽、揮發(fā)油、寡糖和人參多糖等。人參多糖主要是由人參淀粉和人參果膠兩部分組成。人參淀粉是淀粉樣葡聚糖，來(lái)源于造粉體;人參果膠為含有半乳糖醛酸(GalA)的一大類多糖分子，來(lái)源于人參根細(xì)胞壁。研究表明人參果膠具有調(diào)節(jié)免疫、抗輻射、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等活性。但目前對(duì)人參果膠在細(xì)胞壁中的分布情況以

2、及精細(xì)結(jié)構(gòu)缺少全面系統(tǒng)的研究。本論文通過(guò)免疫組化的方法，利用抗體作為探針對(duì)植物細(xì)胞壁多糖的分布進(jìn)行了研究。然后提取分離人參多糖，在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用酶水解、離子交換和凝膠層析等組合方法制備人參果膠分子的各種結(jié)構(gòu)域，研究其分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果如下:
　　利用細(xì)胞壁多糖抗體，采用免疫組化的方法，結(jié)合堿處理和酶作用研究了結(jié)晶化纖維素、半纖維素、果膠和蛋白聚糖這些細(xì)胞壁多糖或蛋白多糖在人參根中的分布和含量。人參根初級(jí)

3、細(xì)胞壁多糖組成為:結(jié)晶化的纖維素、木葡聚糖、甘露聚糖、Ⅰ型聚鼠李半乳糖醛酸(RG-Ⅰ)型果膠結(jié)構(gòu)域、阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)以及高度甲酯化的同聚半乳糖醛酸(HG)結(jié)構(gòu)域。次級(jí)細(xì)胞壁主要含有木聚糖、extensin以及未甲酯化和乙?；腍G型果膠。AGP蛋白聚糖分布比較廣泛，分布于人參根中的三個(gè)部位:淀粉粒表面，初級(jí)細(xì)胞壁以及樹(shù)脂道中。經(jīng)研究證明在人參根中HG能夠掩蓋一些多糖的抗原表位，這種現(xiàn)象廣泛存在于植物體中。HG能夠掩蓋半纖維素

4、的抗原表位證明了HG和半纖維素之間存在某種方式的連接;HG能夠掩蓋阿拉伯聚糖和AGP糖基的抗原表位，但是不能掩蓋半乳聚糖的抗原表位，進(jìn)一步表明了在植物體中果膠分子組建成為高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)HG和半乳聚糖裝配于高級(jí)結(jié)構(gòu)的表面，而阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖包裹于高級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)分級(jí)人參多糖的方法，制備出人參多糖的五個(gè)級(jí)分WGPA-H、WGPA-1、WGPA-2、WGPA-3和WGPA-4，再根據(jù)分子量分布用凝膠層析將WG

5、PA-1～WGPA-4進(jìn)一步分級(jí)得到WGPA-1-HG～WGPA-4-HG四個(gè)HG結(jié)構(gòu)域和WGPA-1-RG～WGPA-4-RG四個(gè)RG結(jié)構(gòu)域。為制備非HG型結(jié)構(gòu)域，將人參果膠WGPA用果膠酶水解除去其中的HG結(jié)構(gòu)域，然后采用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱，以0、0.07、0.16、0.22和0.3 M的NaCl水溶液分步洗脫，得到相應(yīng)的五個(gè)級(jí)分WGPA-UD1、WGPA-UD2、WGPA-UD3、WGPA-

6、UD4和WGPA-UD5。根據(jù)分子量大小的不同，用凝膠柱層析將WGPA-UD2～WGPA-UD5進(jìn)一步純化得到RG-Ⅰ-1、RG-Ⅰ-2、RG-Ⅰ-3A、RG-Ⅰ-3B和RG-Ⅰ-4五個(gè)RG-Ⅰ級(jí)分以及AG1、AG2兩個(gè)AG級(jí)分和HM-HG一個(gè)HG級(jí)分。
　　通過(guò)酶學(xué)方法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜、13C-核磁共振(13C NMR)分析測(cè)定人參果膠多糖各級(jí)分的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明WGPA-1-HG和WGPA-2-HG主要含有甲酯

7、化和乙酰化的HG，另外還有少量的RG-Ⅰ型果膠，其側(cè)鏈為Ⅱ型阿拉伯半乳聚糖(AGⅡ)。WGPA-3-HG是甲酯化非常高的HG，WGPA-4-HG是未酯化的HG型果膠，在這兩個(gè)級(jí)分中也存在短的AGⅡ。RG-Ⅰ-2、RG-Ⅰ-3A、RG-Ⅰ-3B和RG-Ⅰ-4都是帶有RG-Ⅰ型和聚GalA片段的結(jié)構(gòu)域的多糖分子。RG-Ⅰ-2和RG-Ⅰ-3B的分子量較小，為5 Kd，GalA的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鼠李糖(Rha)含量。通過(guò)NMR結(jié)果顯示RG-Ⅰ-2和

8、RG-Ⅰ-3B的甲酯化和乙?；缺容^高，說(shuō)明這兩個(gè)級(jí)分中含有長(zhǎng)的甲酯化或者乙酰化的聚GalA片段。這兩個(gè)級(jí)份的側(cè)鏈比較復(fù)雜，有阿拉伯半乳聚糖。RG-Ⅰ-3A和RG-Ⅰ-4的分子量大于50 Kd，在這兩個(gè)級(jí)分中Rha/GalA的比例分別為0.34和0.64，它們的乙?；冉?00％，說(shuō)明這兩個(gè)級(jí)分中都含有高乙?；木跥alA片段，其側(cè)鏈為阿拉伯半乳聚糖，半乳聚糖和少量的阿拉伯聚糖。應(yīng)用細(xì)胞壁抗體檢測(cè)這些果膠中含有的抗原表位，發(fā)現(xiàn)在樹(shù)脂道

9、中結(jié)合的抗體與這些RG-Ⅰ果膠結(jié)構(gòu)域都有很強(qiáng)的結(jié)合，而在樹(shù)脂道中沒(méi)有結(jié)合的抗體也不能與這些RG-Ⅰ果膠結(jié)構(gòu)域結(jié)合，由此推測(cè)人參水提果膠多糖來(lái)源于人參根的樹(shù)脂道以及組成樹(shù)脂道的上皮細(xì)胞。
　　RG-Ⅰ-3A和RG-Ⅰ-4兩個(gè)級(jí)分經(jīng)過(guò)各種與果膠相關(guān)的酶進(jìn)一步水解或者部分酸水解處理之后，再采用13C NMR和酶聯(lián)免疫吸附法分析得到的多糖分子，以便探討RG-Ⅰ-3A和RG-Ⅰ-4的精細(xì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明RG-Ⅰ-4具有較長(zhǎng)的高度乙?；木跥a

10、lA片段。RG-Ⅰ-4的主鏈以α-(1→4)-GalpA構(gòu)成的HG型結(jié)構(gòu)域作為“平滑區(qū)”，以[→4）-α-GalpA-(1→2)-α-Rhap-（1→]構(gòu)成的RG-Ⅰ型結(jié)構(gòu)域連接較多側(cè)鏈形成的“毛發(fā)區(qū)”。RG-Ⅰ-3A的主鏈由兩部分組成，四糖結(jié)構(gòu)域[→4）-α-GalpA-(1→4)-α-GalpA(1→4)-α-GalpA-(1→2)-α-Rhap-(1→]n以及二糖結(jié)構(gòu)域[→4)-α-GalpA-(1→2)-α-Rhap-（1→]n

11、。RG-Ⅰ-3A和RG-Ⅰ-4的GalA全部在O-2或者0-3被乙?；〈?。
　　由13C NMR和酶聯(lián)免疫吸附法的結(jié)果也推測(cè)RG-Ⅰ-3A和RG-Ⅰ-4的側(cè)鏈相似，側(cè)鏈多且較短，RG-Ⅰ-3A的側(cè)鏈取代度為71％，RG-Ⅰ-4的取代度為67％，側(cè)鏈有以下種形式:[α-1，5-Araf]5-7，[α-1，5-Araf]1-4，含量較低，更多的Ara處于非還原末端;少量的[β-1，4-Galp]4-6，80％以上的[β-1，4-Ga