雞毒支原體遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）是引起雞慢性呼吸道疾病的重要病原。國內(nèi)的控制與預(yù)防策略傾向于使用F36弱毒疫苗株。MG F36株對雞安全，具有良好的呼吸道定植能力，能夠誘導(dǎo)粘膜免疫，持續(xù)產(chǎn)生免疫保護。為了開發(fā)MGF36株的應(yīng)用潛力，我們擬構(gòu)建MG基因操作系統(tǒng)，嘗試以MG F36株作為載體，表達其他呼吸道疾病的免疫抗原基因，為探索MG載體新型疫苗奠定基礎(chǔ)。目前，我們獲得如下結(jié)果:
　　1.利用大腸

2、桿菌的LacZ基因作為報告基因，融合MG S6株粘附蛋白GapA啟動子，借助轉(zhuǎn)座子pMT85，建立雞毒支原體遺傳轉(zhuǎn)化方法。操作簡便無需特殊儀器及耗材，轉(zhuǎn)化效率也能滿足實驗要求。通過優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化法/PEG轉(zhuǎn)化法，成功將轉(zhuǎn)座子插入MG F36株和MG S6株的基因組中。轉(zhuǎn)化后的MG陽性菌株能夠在慶大霉素抗性平板上生長，菌落形態(tài)呈油煎蛋樣，帶有明顯藍色。
　　重復(fù)數(shù)次轉(zhuǎn)化操作后，最終的到了包含600個突變體的轉(zhuǎn)座子庫。隨機挑選12株通過

3、FM-4液體培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，并用PCR檢測驗證突變體的穩(wěn)定。結(jié)果在無抗性培養(yǎng)基上，連續(xù)傳至25代，均能擴增出轉(zhuǎn)座子上的慶大霉素抗性基因，說明轉(zhuǎn)座子在雞毒支原體中有良好的穩(wěn)定性。
　　2.以pMD-18T為骨架，先后克隆并插入約1800bp的MG長復(fù)制區(qū)(Long oriC)和808bp的MG短復(fù)制區(qū)(Short oriC)以及慶大霉素抗性基因，構(gòu)建大腸桿菌-雞毒支原體的穿梭質(zhì)粒。同時也將LacZ基因表達盒克隆至穿梭質(zhì)粒上，構(gòu)建報告

4、質(zhì)粒，檢驗穿梭質(zhì)粒的表達效率。用穿梭質(zhì)粒和報告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化F36株，并涂布含慶大霉素抗性的平板。結(jié)果在抗性平板上長出了陽性菌落，而用報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后長出的菌落也能夠產(chǎn)生藍斑，而且在抗性條件下能夠傳代。但再用無抗性X-gal培養(yǎng)基檢測，大部分的菌落不能夠產(chǎn)生藍斑，這說明菌體中的質(zhì)粒不穩(wěn)定，在傳代過程中會丟失。
　　3.克隆禽流感病毒H5亞型的HA1基因，并在3'端加入Flag標(biāo)簽，與GapA啟動子融合，克隆到轉(zhuǎn)座子載體pMT85中構(gòu)建