犬瘟熱病毒南京分離株核蛋白基因的克隆、表達及其免疫小鼠誘導的免疫應答.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病，是我國當前對養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護業(yè)危害最大的疫病之一。常規(guī)弱毒疫苗雖然在CD防控中發(fā)揮了非常重要的作用，但是也存在諸多缺點。為了研究新一代安全、高效的CD基因工程疫苗，本研究對CDV南京分離株(CDV-NJl5)核衣殼蛋白(N)基因進行了克隆、序列分析，分別構建了N基因的原核表達載體和真核表達載體，對表達產(chǎn)物

2、的免疫原性進行了初步研究，并進行了小鼠的DNA免疫試驗，測定重組質粒誘導的抗體效價。 根據(jù)GenBank上發(fā)表的CDV毒株序列設計一對跨越N基因編碼區(qū)的引物，采用RT-PCR方法擴增CDV-NJ15 N基因，并將其插入到pMD 18-T 中，構建克隆載體pMD-N。經(jīng)序列測定，克隆的N基因長1572bp，編碼523個氨基酸。比較GenBank中收錄的其它CDV毒株序列，發(fā)現(xiàn)它與Onderstepoort疫苗株和Convac疫苗株的核苷

3、酸同源性均為99.7％，氨基酸同源性為99.4％。與其他分離株的核苷酸同源性94.0～95.1％，氨基酸同源性為97.5～98.3％。推測CDV-NJl5是CDV疫苗株的變異株。以CDV-NJl5為模板，設計兩對引物，分段擴增得到了N基因上下游的981bp和702bp兩個片段，將其分別。T-A克隆到pMD　18-T載體后，再亞克隆到原核表達載體pET-32a(＋)中，然后將重組質粒轉化進宿主菌BL2l中，在37℃1mM IPTG誘導下兩

4、個片段均獲得良好的表達。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其表達的融合蛋白約56.1和44.8kD，與預期值一致。免疫轉印試驗顯示，兩個重組蛋白均可被CDV Onderstepoort株兔抗血清識別，表明該重組蛋白具備天然N蛋白的部分抗原性。為探索更為敏感的診斷方法和研制CDV新型疫苗創(chuàng)造條件。 對克隆載體pMD-N進行雙酶切，將得到的CDV-NJ15 N基因定向克隆到pcDNA3.1(-)真核表達載體中，通過磷酸鈣介導轉染COS-7細胞，用SD

5、S-PAGE和Western-blot分別鑒定表達產(chǎn)物的相對分子量及其免疫原性。結果證明獲得正向插入的pcDNA-N重組表達質粒，表達產(chǎn)物的相對分子量約58.2kD，與預期值大小一致，且該表達產(chǎn)物能夠被CDV-Onderstepoort株的兔抗血清識別，表明構建的pcDNA-N重組質粒能在哺乳動物細胞中表達并且具有抗原性。以構建好的CDV N和H基因真核表達載體pcDNA-N和pcDNA-H為基因疫苗，分組免疫6周齡昆明系小鼠，以2周為

6、間隔，共免疫4次，最后一次免疫3周后眼眶采血分離血清。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)和病毒中和試驗(SN)分析基因免疫在小鼠體內(nèi)誘導的免疫應答。結果顯示pcDiNA-N和pcDNA-H單獨免疫分別激發(fā)了10<'2.69±0.149>和10<'0.63±0.147>滴度的ELISA抗體，聯(lián)合免疫激發(fā)了10<'2.93±0.165>滴度的ELISA抗體，低于弱毒疫苗產(chǎn)生的抗體滴度(10<'3.35±0.252>)，兩者差異顯著(p<0.05