人乳腺腫瘤酪氨酸磷酸化差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景及目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,目前其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)。而乳腺癌是一種全身性的疾病,單純的手術(shù)治療不能顯著提高其生存率。為了提高其治愈率,乳腺癌的綜合治療顯得非常重要。近年來,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了HER-2基因在20％～30％的乳腺癌中存在明顯擴(kuò)增和過表達(dá),并針對(duì)性的研究出來了赫賽汀(herceptin)這種藥物臨床應(yīng)用取得了很好的效果。
　　 乳腺癌其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因及多途徑改變的復(fù)雜過

2、程,其癌變機(jī)制仍不是十分明確。本實(shí)驗(yàn)從酪氨酸磷酸化修飾入手,研究乳腺腫瘤蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的表達(dá)差異。為研究乳腺癌發(fā)生,發(fā)展,治療,檢測(cè)及防治研究開辟新的思路。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)收集了20例乳腺癌惡性腫瘤和12例乳腺癌良性腫瘤的新鮮標(biāo)本,采用酪氨酸磷酸化免疫富集的方法收集多肽,并用LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定分析,對(duì)可能有意義的差異表達(dá)酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)采用免疫印跡技術(shù)加以驗(yàn)證。并在四例乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng),收集培養(yǎng)

3、后的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行差異酪氨酸磷酸化蛋白研究,比較人乳腺癌和癌株在酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,為乳腺癌的進(jìn)一步研究提供模型。
　　 結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)對(duì)人乳腺腫瘤的研究中共找到了772種酪氨酸磷酸化差異性蛋白質(zhì),其中在惡性腫瘤中有581種磷酸化差異蛋白上調(diào),良性腫瘤中有191種酪氨酸磷酸化蛋白上調(diào)。根據(jù)P＜0.05,良惡性腫瘤中鑒別出來了116種酪氨酸磷酸化差異蛋白質(zhì)。另外在惡性腫瘤中根據(jù)P＜0.05中的P數(shù)值由低到高排列出來了51種

4、差異化酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了PKCD、CDCP1、AXL在人乳腺癌中表達(dá)上調(diào)。IGF1R在人乳腺纖維瘤中表達(dá)上調(diào)。并應(yīng)用免疫印跡法驗(yàn)證(WesternBlotting)PKCD、CDCP1酪氨酸磷酸化等蛋白質(zhì)。我們還選擇了Cal-85-1、hcc-1599、du-4475、MCF-7等四株乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng),收獲乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)了Cal-85-1、hcc-1599、du-4475這三株乳腺癌株中PKCD、C

5、DCP1表達(dá)上調(diào),而MCF-7乳腺癌株中PKCD、CDCP1未見明顯表達(dá)。并通過免疫印跡法(Western Blotting)對(duì)PKCD、CDCP1等加以驗(yàn)證。
　　 結(jié)論:1.收集了乳腺癌及乳腺纖維瘤組織,并培養(yǎng)了乳腺癌細(xì)胞株,裂解并富集了酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì),為今后的乳腺癌酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。
　　 2.本次試驗(yàn)首次應(yīng)用酪氨酸磷酸化免疫沉淀的方法富集了乳腺腫瘤及細(xì)胞株的酪氨酸磷酸化蛋白,初步探索

6、了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和治療,及預(yù)后檢測(cè)的分子機(jī)制,為乳腺癌的診斷提供了新的腫瘤標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)避免了以往磷酸化蛋白質(zhì)研究及腫瘤發(fā)病機(jī)制,進(jìn)程及治療等領(lǐng)域研究針對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的局限性。首次把酪氨酸磷酸化定量蛋白應(yīng)用于乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療的研究?？朔似胀p向凝膠電泳重復(fù)性差,動(dòng)態(tài)范圍小的缺點(diǎn)。并且建立新的定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線,并掌握了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本方法。
　　 3.篩選了多個(gè)乳腺腫瘤差異性磷酸化蛋白質(zhì),其中PKCD、CDC

7、P1、AXL、IGF1R等在乳腺癌細(xì)胞中參與了各項(xiàng)生理過程,其中的一些為乳腺癌的個(gè)體化治療提供潛在靶向藥物,另一些能夠作為腫瘤標(biāo)志物對(duì)乳腺癌疾病的診斷和術(shù)后檢測(cè)提供信息。
　　 4.在Cal-85-1、Hcc-1599、Du-4475等細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)了與乳腺癌中表達(dá)量上調(diào)一致的PKCD、CDCP1等酪氨酸磷酸化差異蛋白質(zhì),這些細(xì)胞株能夠?yàn)檠芯课磥磉@些蛋白質(zhì)功能和新藥研發(fā)提供模型。本實(shí)驗(yàn)研究為未來乳腺癌的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。