嗜水氣單胞菌生物被膜形成和估算方法.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是多種動物的重要病原菌，并可引起人的胃腸炎、敗血癥等疾病，對該菌的研究受到廣泛關(guān)注。Ah可形成生物被膜(biofilm，BF)，被膜菌具有不同于浮游菌的各種特性。本試驗(yàn)建立了BF估算方法，優(yōu)化Ah BF的產(chǎn)生條件，并比較了口服Ah BF疫苗及口服全菌滅活疫苗免疫的效果。 1 根據(jù)O’Toole和Kolter建立的方法改進(jìn)，過夜培養(yǎng)的Ah J-1平板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用PBS

2、稀釋成16個(gè)稀釋度。從每個(gè)稀釋度取200 μL用1％(w／v)結(jié)晶紫染色20 min，離心洗滌3次，自然晾干，90％乙醇萃取結(jié)晶紫，測A<,590>如吸光值。建立細(xì)菌數(shù)對數(shù)與吸光值之間的線性關(guān)系。同樣方法染色生物被膜，測A<,590>吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的細(xì)菌數(shù)，該細(xì)菌數(shù)可視為形成生物被膜的細(xì)菌數(shù)量，建立用生物被膜含細(xì)菌數(shù)量估算生物被膜的方法。同時(shí)用顯微鏡和掃描電鏡進(jìn)行Ah BF的定性分析，結(jié)果顯示所建立的結(jié)晶紫染色方法可估算生

3、物被膜的量。 2 在自然環(huán)境中，細(xì)菌主要的生存方式是在載體上以生物被膜形式存在。本試驗(yàn)從培養(yǎng)基和介質(zhì)兩方面研究了生物被膜產(chǎn)生的影響條件。結(jié)果顯示MM9和Mg+LB能促進(jìn)嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，并且Mg<'2+>只在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)BF的形成，而LB+MOPS和3LB+Glucose兩培養(yǎng)基則抑制其形成；表面粗糙的甲殼素較聚苯乙烯更有利于BF的形成。 3 將熱滅活的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophil

4、a)生物被膜(biofilm，BF)菌苗以佐劑形式加入Ah J-1的浮游細(xì)菌制備BF菌苗。按獸用生物制品制造規(guī)程制備口服Ah滅活疫苗，進(jìn)行小鼠免疫。試驗(yàn)分為口服BF、口服全菌滅活、注射全菌滅活和空白對照四組， 16只／組?？诜﨎F和口服全菌滅活疫苗組分別按10<'8>和10<'9>CFU／(100g·d<'-1>)喂養(yǎng)，連續(xù)投喂15天；注射組按0.5 mL／只(10<'7>CFU／只)劑量腹腔注射，15天后加強(qiáng)免疫。ELISA測定抗體