依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：腦梗死是目前危害人類健康的常見(jiàn)疾病，致殘率、病死率高。人們對(duì)于急性缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制研究已久，但預(yù)后仍然很差。臨床上仍缺乏療效確切、被廣泛認(rèn)可的腦保護(hù)劑。急性腦梗死病灶由中心壞死區(qū)及周圍的缺血半暗帶組成。半暗帶由于存在側(cè)枝循環(huán)，尚有大量可存活的神經(jīng)元，盡快恢復(fù)血供、保護(hù)這些可逆性損傷的神經(jīng)元是腦梗死的治療關(guān)鍵。但是再灌注本身可能加重缺血所致的損傷，稱為缺血-再灌注(I-R)損傷。目前認(rèn)為自由基的作用是缺血-再灌注損傷的重要發(fā)

2、病學(xué)環(huán)節(jié)，有資料表明，自由基對(duì)腦缺血組織損傷依賴于缺血后再灌注，即在重新給氧的情況下，自由基的生成比在單純?nèi)毖闆r下要大大增加，有效清除自由基是減輕腦缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)之一。隨著科學(xué)的發(fā)展，抗自由基保護(hù)劑在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中所起的作用越來(lái)越引起人們的注意。其中依達(dá)拉奉對(duì)再灌注損傷中腦組織的保護(hù)作用尤其引起學(xué)者們的關(guān)注，臨床應(yīng)用前景廣泛。依達(dá)拉奉是一種新研發(fā)的自由基清除劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均顯示其有效的腦保護(hù)作用。但研究大都集中整

3、體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平以及臨床患者癥狀體征指標(biāo)的檢測(cè)方面，缺乏確切的分子細(xì)胞水平的研究證據(jù)。因此，進(jìn)一步明確其保護(hù)作用發(fā)生的分子機(jī)制有著重要意義，可為臨床早期使用自由基清除劑、改善預(yù)后，提供可靠的理論基礎(chǔ)。 目的：通過(guò)將沙土鼠制成腦缺血再灌注模型，用依達(dá)拉奉干預(yù)后，在整體水平上探討依達(dá)拉奉的保護(hù)作用。檢測(cè)其腦組織勻漿中丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性，探討依達(dá)拉奉對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響。并用電鏡、免疫組化檢測(cè)腦組織切片中神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和凋亡

4、情況。原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，模擬缺血再灌注損傷，在細(xì)胞水平探討依達(dá)拉奉對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化、神經(jīng)元游離Ca2+濃度和線粒體膜電位的影響，以及對(duì)早期、晚期細(xì)胞凋亡的作用。為自由基清除劑依達(dá)拉奉的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：1.在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上，依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究。 (1)建立沙土鼠全前腦缺血再灌注損傷模型，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10min后，松開動(dòng)脈夾形成再灌注。沙土鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注

5、組(模型組)、腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉干預(yù)組(依達(dá)拉奉組)。依達(dá)拉奉組在再灌注當(dāng)時(shí)給予依達(dá)拉奉10mg/kg腹腔注射。模型組注射等量生理鹽水，假手術(shù)組除不夾閉頸總動(dòng)脈，余過(guò)程同模型組。每組按再灌注時(shí)間3h，6h，12h，24h，48h，72h分6個(gè)亞組，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。 (2)將沙土鼠在再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，制備10﹪腦組織勻漿，檢測(cè)腦組織勻漿中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，反映依達(dá)拉奉的抗脂質(zhì)過(guò)氧

6、化作用和清除自由基水平。 (3)在再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取海馬組織制成透射電鏡標(biāo)本，電鏡下觀察海馬CAl區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和凋亡情況。 (4)通過(guò)免疫組化的方法，TUNEL染色檢測(cè)各組沙土鼠海馬CAl區(qū)細(xì)胞原位凋亡情況。 2、在離體實(shí)驗(yàn)細(xì)胞水平上，探討依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 (1)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，建立模擬缺血再灌注損傷模型，分為正常細(xì)胞組(不加任何干預(yù)措施)、缺氧復(fù)氧組(將海馬神經(jīng)元缺氧培養(yǎng)2

7、h，復(fù)氧24h)、依達(dá)拉奉干預(yù)組(復(fù)氧當(dāng)時(shí)分別給予1、10、100、300μmol/L依達(dá)拉奉干預(yù))和陽(yáng)性參照藥維生素C干預(yù)組(復(fù)氧當(dāng)時(shí)給予l00umol/L維生素C干預(yù))，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA、SOD含量。 (2)將各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞用鈣離子敏感性染料Fluo-3AM和線粒體膜電位敏感性染料Rhodamine-123進(jìn)行染色后，激光共聚焦顯微鏡分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度和線粒體膜電位。 (3)采用AnnexinV

8、/PI雙染法和DNA含量測(cè)定法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)依達(dá)拉奉對(duì)各組海馬神經(jīng)元模擬缺血再灌注損傷后細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的影響。 結(jié)果：1.依達(dá)拉奉對(duì)沙土鼠前腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(1)沙土鼠前腦缺血再灌注損傷模型中，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組SOD活性無(wú)顯著性差異，缺血再灌注損傷后SOD活性下降，模型組SOD活性明顯低于假手術(shù)組(p＜0.05)，在缺血再灌注3h即可見(jiàn)SOD活力下降，給予依達(dá)拉奉干預(yù)能明顯提高SOD活力，依達(dá)拉奉組在每

9、個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD活力均高于模型組(p＜0.05)。 (2)假手術(shù)組MDA含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。缺血再灌注損傷后，模型組再灌注3hMDA含量即上升(1.94±0.15nmol/mg.prot)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，MDA持續(xù)升高(72h高達(dá)4.51士0.45nmol/mg.prot)。依達(dá)拉奉干預(yù)能有效地降低MDA水平，依達(dá)拉奉組在各時(shí)間點(diǎn)MDA含量均較模型組低(3h：1.54±0.32nmol/mg.prot，72h：3.07

10、±0.34nmol/mg.prot，p＜0.05)。 (3)透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：假手術(shù)組海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞基本沒(méi)有損傷表現(xiàn)，胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體內(nèi)嵴排列整齊、清晰，胞核形態(tài)規(guī)則，核膜完整；染色質(zhì)疏松均勻。再灌注24h以后損傷明顯加重，出現(xiàn)凋亡改變。細(xì)胞膜、核膜不完整，核膜部分皺褶，核質(zhì)不均勻，染色質(zhì)聚集靠邊，附于核膜，線粒體斷裂或消失。缺血再灌注損傷給予依達(dá)拉奉干預(yù)組的損傷較相同時(shí)間點(diǎn)未加依達(dá)拉奉干預(yù)組程度輕。

11、 (4)TUNEL染色計(jì)數(shù)海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞凋亡情況：假手術(shù)組海馬CAl區(qū)TUNEL染色細(xì)胞凋亡不明顯，缺血再灌注損傷6h，12h染色陽(yáng)性細(xì)胞開始增多，24h，48h，72h均見(jiàn)大量TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，缺血再灌注損傷+依達(dá)拉奉組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，在各時(shí)間點(diǎn)與單純損傷不加依達(dá)拉奉干預(yù)組相比均存在顯著性差異。 2.依達(dá)拉奉對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞模擬缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 (1)海馬神經(jīng)元在正常生

12、長(zhǎng)狀態(tài)下脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量為0.57±0.08nmol/ml，SOD活性54.36±5.58U/ml。H/R損傷后，海馬神經(jīng)元內(nèi)MDA含量增高(1.47±0.15nmol/m1)，SOD活性下降(26.40±3.77U/m1)，表明細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基的能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加。用100μmol/L和300μmol/L依達(dá)拉奉干預(yù)均能有效地增高細(xì)胞內(nèi)SOD活性(兩組細(xì)胞中SOD活性分別為48.11±5.54U/ml，47.32±

13、5.82U/m1)，降低MDA含量(兩組細(xì)胞中MDA含量分別為0.87±0.11nmol/ml，0.90±0.13nmol/m1)。 (2)與正常對(duì)照組比較，缺氧復(fù)氧組(H/Rcontr01)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加81﹪(P＜0.01)。缺氧復(fù)氧加依達(dá)拉奉1，10μmol/L組(1，10μM組)和維生素C(VC)組對(duì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)明顯影響(P＞0.05)。與H/Rcontrol組比較，缺氧復(fù)氧加依達(dá)拉奉100，300μmol/L

14、組的胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低了35﹪(P＜0.01)和36﹪(P＜0.01)。 (3)與正常細(xì)胞相比，缺氧再?gòu)?fù)氧后，海馬神經(jīng)元的線粒體膜電位降低了60﹪。給予低濃度依達(dá)拉奉(1和10μmol/L)及100μmol/L維生素干預(yù)，對(duì)海馬神經(jīng)元的MMP沒(méi)有影響。而加入100和300μmol/L依達(dá)拉奉可以顯著提高損傷海馬神經(jīng)元的MMP(分別為110±6.03和116±8.94)，達(dá)到正常神經(jīng)元MMP的82﹪和87﹪。 (4)正

15、常生長(zhǎng)狀態(tài)下的海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生早期凋亡率很低(1.41﹪)，而缺氧再?gòu)?fù)氧損傷后海馬神經(jīng)元的早期凋亡率急劇增加到58.27﹪，與缺氧復(fù)氧組相比，10μmol/L的依達(dá)拉奉干預(yù)能輕度減少神經(jīng)元早期凋亡(細(xì)胞早期凋亡率為41.51﹪)，100μmol/L和300μmol/L的依達(dá)拉奉的細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)，可將早期凋亡率降28.82﹪和23.55﹪(P＜0.01)。 (5)正常生長(zhǎng)狀態(tài)下海馬神經(jīng)元晚期凋亡率僅有0.04﹪，在缺血再灌注損

16、傷后可以明顯誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡(56.94﹪)，100μmol/L維生素C可輕度降低細(xì)胞晚期凋亡率(45.42﹪)，而加入100μmol/L和300μmol/L依達(dá)拉奉干預(yù)后，細(xì)胞晚期凋亡率大大降低(分別降至27.83﹪和25.03﹪)。 結(jié)論：1.在再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，與不加依達(dá)拉奉干預(yù)的單純?nèi)毖俟嘧p傷組相比，依達(dá)拉奉干預(yù)組沙土鼠腦組織MDA明顯含量下降，SOD活性大幅度提高，證實(shí)依達(dá)拉奉具有清除氧自由基、抑制

17、脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。 2.電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察及TUNEL染色檢測(cè)結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷后，依達(dá)拉奉能有效地保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞的凋亡數(shù)。 3.培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在缺氧復(fù)氧損傷后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性下降，MDA含量增高，表明細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基的能力下降，脂質(zhì)過(guò)氧化增加。用依達(dá)拉奉干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性增高，MDA含量下降，提示依達(dá)拉奉可清除氧自由基，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，這有助于穩(wěn)定細(xì)胞膜，減輕氧自由基對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷