自然殺傷T細(xì)胞在異基因造血干細(xì)胞移植aGVHD中的免疫調(diào)控研究.pdf

1、一、小鼠NKT細(xì)胞體內(nèi)外擴(kuò)增、純化和鑒定
　　 目的：探討小鼠體外Ⅰ型NKT細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)體系的建立及體內(nèi)實施α-GalCer負(fù)載的樹突狀細(xì)胞(α-GalCer-loaded DC)對小鼠NKT細(xì)胞的擴(kuò)增活化效應(yīng)。
　　 方法：C57BL/6小鼠脾細(xì)胞分別在含α-GalCer(100 ng/ml)、α-GalCer(100ng/ml)+IL-2(100 IU/ml)和α-GalCer(100 ng/ml)+IL-2(100

2、 IU/ml)+IL-7(20 ng/ml)的體外擴(kuò)增體系擴(kuò)增培養(yǎng)。體內(nèi)分2組分別注射α-GalCer(2μg/mouse)和α-GalCer-loaded DC(1×106/mouse)擴(kuò)增NKT細(xì)胞。采用α-GalCer-loaded CD1dtetramer和TCRβ單抗雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測NKT細(xì)胞比例，比較不同培養(yǎng)體系NKT細(xì)胞的擴(kuò)增效率。免疫磁珠分選α-GalCer-loaded DC體內(nèi)擴(kuò)增的NKT細(xì)胞并進(jìn)行純度鑒定。EL

3、ISA法測定體內(nèi)、體外擴(kuò)增第7天小鼠血清、培養(yǎng)上清中的IL-4、IFNγ水平。
　　 結(jié)果：體外擴(kuò)增培養(yǎng)第8天，α-GalCer、α-GalCer+IL-2、α-GalCer+IL-2+IL-7三組NKT細(xì)胞比例分別為(8.70±1.97)％、(27.28±5.26)％、(51.25±7.80)％，α-GalCer+IL-2和α-GalCer+IL-2+IL-7較α-GalCer具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義的(P<0.01)，α-Gal

4、Cer+IL-2+IL-7較α-GalCer+IL-2擴(kuò)增比例顯著增加(P=0.0327)。體內(nèi)擴(kuò)增體系中，α-GalCer組和α-GalCer-loaded DC組在C57BL/6小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞中，NKT細(xì)胞比例分別為：(15.46±2.63)％、(28.89±3.92)％；(38.41±3.91)％、(52.46±5.23)％。脾細(xì)胞中α-GalCer-loaded DC組較α-GalCer組具有明顯的擴(kuò)增效率(P=0.031

5、5)；胸腺細(xì)胞中，雖然α-GalCer-loaded DC組的擴(kuò)增比例高于α-GalCer組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。免疫磁珠分選NKT細(xì)胞純度高于90％。ELISA測定結(jié)果顯示：α-GalCer-loaded DC較α-GalCer顯著增加血清IL-4、IFNγ的分泌(P=0.0406，P=0.0129)；α-GalCer+IL-2和α-GalCer+IL-2+IL-7較α-GalCer明顯增加培養(yǎng)上清中IL-4、IFNγ分泌

6、，α-GalCer+IL-2+IL-7和α-GalCer+IL-2比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：體外采用α-GalCer聯(lián)合IL-2可有效擴(kuò)增NKT細(xì)胞，加用IL-7可明顯提高擴(kuò)增效率。體內(nèi)實施α-GalCer-loaded DC可顯著擴(kuò)增NKT細(xì)胞。體內(nèi)外擴(kuò)增活化的NKT細(xì)胞可分泌大量IL-4和IFNγ。
　　 二、建立小鼠異基因骨髓移植aGVHD模型
　　 目的：建立C57BL/B6→BAL

7、B/c小鼠清髓性異基因骨髓移植aGVHD模型。
　　 方法：25只SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，各組小鼠分別接受7 Gy、7.5 Gy、8 Gy、8.5 Gy、9 Gy X射線全身照射(TBI)。20只BALB/c小鼠經(jīng)預(yù)處理后隨機(jī)分為4組，分別尾靜脈輸注1×106、2.5×106、5×106、10×106個骨髓細(xì)胞重建造血。在能重建造血的基礎(chǔ)上建立aGVHD模型。為確定誘發(fā)不同程度aGVHD的脾細(xì)胞劑量，在輸注骨髓細(xì)胞

8、10×106基礎(chǔ)上輸注1×106、5×106、10×106個脾細(xì)胞，每個劑量組5只BALB/c小鼠。移植后觀察aGVHD表現(xiàn)和生存率，2～3周取皮膚、肝臟、回腸進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，3～4周進(jìn)行嵌合度檢測。
　　 結(jié)果：接受7 Gy劑量的小鼠，生存率為20％，中位生存期為22天；接受7.5 Gy、8 Gy、8.5Gy、9 Gy劑量的小鼠全部死于造血衰竭，中位生存期分別為18、12、9、7天。四組生存時間采用Log-rank檢驗，x

9、2=18.85，P<0.0001。輸注1×106、2.5×106骨髓細(xì)胞不能全部重建造血，60天生存率分別為40％和60％。輸注5×106、10×106骨髓細(xì)胞可全部重建造血，60天生存率100％。四組生存時間采用Log-rank檢驗，x2=6.78，P=0.0092。單純輸注骨髓細(xì)胞不能誘發(fā)aGVHD。低劑量脾細(xì)胞輸注小鼠aGVHD程度輕，僅出現(xiàn)20％aGVHD相關(guān)死亡，中劑量和高劑量脾細(xì)胞輸注小鼠均出現(xiàn)中重度aGVHD，一月內(nèi)全部死

10、亡(P<0.0001)。中重度aGVHD小鼠皮膚、肝臟和腸道可見明顯的病理學(xué)改變。+28天脾細(xì)胞均達(dá)到完全供者嵌合體狀態(tài)。
　　 結(jié)論：TBI7.5 Gy以上對于BALB/c小鼠是致死性預(yù)處理。預(yù)處理后輸注5×106以上骨髓細(xì)胞可全部重建造血。輸注5×106以上脾細(xì)胞可誘發(fā)中重度aGVHD。確定8.5 Gy預(yù)處理，輸注1×107骨髓細(xì)胞和5×106脾細(xì)胞建立清髓性異基因骨髓移植aGVHD模型。
　　 三、宿主NKT細(xì)胞在

11、小鼠異基因骨髓移植aGVHD中的免疫調(diào)控效應(yīng)
　　 目的：探討α-GalCer-loaded DC輸注移植小鼠以擴(kuò)增活化宿主殘存Ⅰ型NKT細(xì)胞，觀察其對小鼠異基因造血干細(xì)胞移植aGVHD的影響。另外，采用經(jīng)α-GalCer-loaded DC體內(nèi)擴(kuò)增活化的宿主Ⅰ型NKT細(xì)胞輸注，觀察宿主NKT細(xì)胞過繼免疫治療對小鼠異基因造血干細(xì)胞移植aGVHD的抑制效應(yīng)。
　　 方法：在C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性異基因骨髓

12、移植aGVHD模型中，分組如下：(1)α-GalCer和α-GalCer-loaded DC組：①BMT對照組：BMCs1×107；②GVHD對照組：BMCs1×107+SCs5×106；③α-GalCer組：BMCs1×107+SCs5×106+α-GalCer(2μg/mouse)；④α-GalCer-loaded DC1組：BMCs1×107+SCs5×106+α-GalCer-loaded DC(1×105)；⑤α-GalCer

13、-loaded DC2組：BMCs1×107+SCs5×106+α-GalCer-loaded DC(5×105)⑥α-GalCer-loaded DC3組：BMCs1×107+SCs5×106+α-GalCer-loaded DC(1×106)。(2)宿主NKT細(xì)胞輸注組：①BMT對照組：BMCs1×107；②GVHD對照組：BMCs1×107+SCs5×106；③宿主NKT細(xì)胞輸注1組：BMCs1×107+SCs5×106+NKT(

14、5×105)；④宿主NKT細(xì)胞輸注2組：BMCs1×107+SCs5×106+NKT(1×106)。移植后采用臨床GVHD積分評價各組小鼠aGVHD嚴(yán)重程度；病理組織學(xué)檢查評價皮膚、肝臟、小腸的病理損傷；Log-rank檢驗各組生存率；ELISA法測定移植后第7天小鼠血清中的IL-4、IL-10、IFNγ、TNFα和CCL8水平。此外，模擬allo-BMT可能出現(xiàn)的體內(nèi)異基因反應(yīng)建立體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)體系，觀察實施α-Gal

15、Cer-loaded DC和宿主NKT細(xì)胞輸注對異源性供者T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響。以C57BL/6供鼠來源的脾細(xì)胞(H2b)作為反應(yīng)細(xì)胞，以絲裂霉素C去增殖的α-GalCer-loaded DC體內(nèi)刺激的BALB/c受鼠脾細(xì)胞(H2d)(SCs stimulated by DC)、未經(jīng)α-GalCer-loaded DC刺激的BALB/c受鼠脾細(xì)胞(H2d)(SCs without stimulation)和宿主NKT細(xì)胞(HostN

16、KT cells)、宿主NKT陰性T細(xì)胞(Host NKT T cells)作為刺激細(xì)胞，在不同濃度梯度下3H摻入法檢測H2b脾細(xì)胞(反應(yīng)細(xì)胞)的增殖效應(yīng)。
　　 結(jié)果：骨髓移植對照組BALB/c小鼠不出現(xiàn)GVHD表現(xiàn)。GVHD對照組小鼠出現(xiàn)中到重度的aGVHD表現(xiàn)。α-GalCer組、α-GalCer-loaded DC1(1×105)組、α-GalCer-loaded DC2(5×105)組、宿主NKT細(xì)胞輸注(5×105)

17、1組和宿主NKT細(xì)胞輸注(1×106)2組臨床GVHD評分均低于GVHD對照組(P<0.05)，其中，以α-GalCer-loaded DC2(5×105)組和宿主NKT細(xì)胞輸注(1×106)2組減低最為明顯；α-GalCer-loaded DC3(1×106)組則出現(xiàn)與GVHD對照組相似或加重的GVHD表現(xiàn)。GVHD對照組小鼠出現(xiàn)明顯的皮膚、肝臟和腸道病理改變。α-GalCer-loadedDC(5×105)組和宿主NKT細(xì)胞輸注組(

18、1×106)小鼠aGVHD靶器官病理改變較GVHD對照組輕。移植后觀察100天，GVHD對照組和α-GalCer-loaded DC3(1×106)組小鼠1月內(nèi)全部死亡。α-GalCer組(28.6％，2/7)、α-GalCer-loaded DC1(1×105)組(16.7％，1/6)、α-GalCer-loaded DC2(5×105)組(50.0％；4/8)較對照組顯著提高生存率(P<0.0001)；α-GalCer-loaded

19、 DC2(5×105)組較α-GalCer組和α-GalCer-loaded DC1(1×105)組能明顯改善生存率(P=0.0243，P=0.0097)。宿主NKT細(xì)胞輸注(5×105)1組(28.6％，2/7)和宿主NKT細(xì)胞輸注(1×106)2組(37.5％；3/8)較對照組顯著提高生存率(P<0.0001)；二者相互比較生存率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ELISA測定細(xì)胞因子結(jié)果顯示：α-GalCer組和α-GalCer-lo

20、adedDC(5×105)組較GVHD對照組顯著增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001)；α-GalCer-loaded DC(5×105)組IL-4的分泌較α-GalCer組明顯增加(P=0.0176)；IFNγ、TNFα在α-GalCer組、α-GalCer-loaded DC(5×105)組、GVHD對照組都呈現(xiàn)較高水平，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；α-GalCer-loaded DC(1×106)組較α-GalCer

21、-loaded DC(5×105)組IFNγ、TNFα分泌水平更高(P<0.05)；宿主NKT細(xì)胞輸注組(1×106)較GVHD對照組顯著增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001)，而IFNγ明顯減少(P=0.0361)；CCL8在各組都明顯增加，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，SCs stimulated by DC較SCs without stimulation能顯著抑制H2b脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)，且抑制

22、強度呈劑量依賴性(P<0.05)。異源性宿主NKT細(xì)胞對H2b反應(yīng)細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，且抑制強度呈劑量依賴性，而宿主NKT陰性T細(xì)胞則無抑制效應(yīng)(P<0.01)。
　　 結(jié)論：小鼠異基因骨髓移植后實施適宜劑量的α-GalCer loaded DC和宿主Ⅰ型NKT細(xì)胞輸注能顯著抑制GVHD的病理進(jìn)程、明顯改善生存率，其機(jī)制主要是通過α-GalCer loaded DC刺激宿主殘存NKT細(xì)胞的活化，NKT細(xì)胞分泌大量Th2型細(xì)

23、胞因子，并抑制異源性T淋巴細(xì)胞的增殖活化而共同發(fā)揮作用。
　　 四、供者NKT細(xì)胞輸注在小鼠異基因骨髓移植aGVHD中的調(diào)控效應(yīng)
　　 目的：采用經(jīng)α-GalCer-loaded DC體內(nèi)擴(kuò)增活化的供者Ⅰ型NKT細(xì)胞輸注，探討供者NKT細(xì)胞過繼免疫治療對小鼠異基因造血干細(xì)胞移植aGVHD的免疫調(diào)控效應(yīng)。
　　 方法：在C57BL/B6→BALB/c小鼠清髓性異基因骨髓移植aGVHD模型中，分組如下：①BMT對照組

24、：BMCs1×107；②GVHD對照組：BMCs1×107+SCs5×106；③供者NKT細(xì)胞輸注1組：BMCs1×107+SCs5×106+NKT(5×105)；④供者NKT細(xì)胞輸注2組：BMCs1×107+SCs5×106+NKT(1×106)。移植后采用臨床GVHD積分評價各組小鼠aGVHD嚴(yán)重程度：病理組織學(xué)檢查評價皮膚、肝臟、小腸的病理損傷；Log-rank檢驗各組生存率；ELISA法測定移植后第7天小鼠血清中的IL-4、IL

25、-10、IFNγ、TNFα和CCL8水平。建立體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)體系，以C57BL/6小鼠來源的脾細(xì)胞(H2b)作為反應(yīng)細(xì)胞，以BALB/c小鼠來源的絲裂霉素C去增殖的脾細(xì)胞(H2d)作為刺激細(xì)胞，并在該MLR體系中加入不同數(shù)量的去增殖C57BL/6供鼠(H2b)來源的分選NKT細(xì)胞(Donor NKTcells)、NKT陰性T細(xì)胞(Donor NKT T cells)。3H摻入法檢測H2b脾細(xì)胞(反應(yīng)細(xì)胞)的增殖效應(yīng)。

26、r>　　 結(jié)果：骨髓移植對照組BALB/c小鼠不出現(xiàn)GVHD表現(xiàn)。GVHD對照組小鼠出現(xiàn)中到重度的GVHD表現(xiàn)。供者NKT細(xì)胞輸注1組(5×105)和2組(1×106)GVHD臨床評分低于GVHD對照組(P<0.05)。供者NKT細(xì)胞輸注組(1×106)小鼠皮膚、肝臟和腸道病理改變較GVHD對照組減輕。移植后觀察100天，GVHD對照組小鼠1月內(nèi)全部死亡。供者NKT細(xì)胞輸注1組(5×105)和2組(1×106)較GVHD對照組顯著提高

27、生存率(P<0.0001)；供者NKT細(xì)胞輸注2組(1×106)生存率(42.9％，3/7)高于NKT細(xì)胞輸注1組(5×105)(25.0％，2/8)(P=0.0375)。ELISA測定細(xì)胞因子結(jié)果顯示：供者NKT細(xì)胞輸注組(1×106)較GVHD對照組顯著增加IL-4、IL-10的分泌(P<0.0001)；IFNγ、TNFα、CCL8在供者NKT細(xì)胞輸注組和GVHD對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，在加入2

28、×105時，供者NKT細(xì)胞較NKT陰性T細(xì)胞對H2b反應(yīng)細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用(P=0.0382)
　　 結(jié)論：小鼠異基因骨髓移植后實施α-GalCer-loaded DC體內(nèi)擴(kuò)增活化的供者Ⅰ型NKT細(xì)胞輸注可明顯改善aGVHD的臨床表現(xiàn)和病理改變、顯著提高生存率，其機(jī)制主要是通過促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子的分泌和抑制供者T淋巴細(xì)胞的增殖活化而產(chǎn)生aGVHD抑制作用。
　　 五、Vα24+Vβ11+NKT細(xì)胞在異基因造血干

29、細(xì)胞移植患者的重建及對aGVHD影響的初步研究
　　 目的：觀察異基因造血干細(xì)胞移植患者Vα24+Vβ11+NKT細(xì)胞的重建及移植物和外周血NKT細(xì)胞數(shù)量對aGVHD的影響。
　　 方法：2010年5月至2010年10月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科接受異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)的38例患者中，男性20例、女性18例，中位年齡33(13～55)歲。實施同胞全相合骨髓移植(MSD-BMT)患者20例，同胞全相

30、合外周血干細(xì)胞移植(MSD-PBSCT)患者4例，無關(guān)供者全相合外周血干細(xì)胞移植(MUD-PBSCT)11例，單倍型骨髓移植(HID-BMT)3例。取骨髓和外周干細(xì)胞的移植物、移植患者+30、+60、+90天及aGVHD發(fā)生時的外周抗凝血，分離MNC以APC-CD3、PE-TCRVα24、FITC-TCRVβ11單抗進(jìn)行三色標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測Vα24+Vβ11+NKT細(xì)胞比例。分析發(fā)生aGVHD和未發(fā)生aGVHD患者的移植物和外周血N

31、KT細(xì)胞數(shù)量對aGVHD的影響。
　　 結(jié)果：38例allo-HSCT患者均獲得造血重建。aGVHD總發(fā)生率63％，其中Ⅰ-Ⅱ度50％，Ⅲ～Ⅳ度13％。+30、+60、+90天外周血NKT細(xì)胞比例分別為：BMT組(0.37±0.10)％、(0.34±0.09)％、(0.48±0.16)％，PBSCT組(0.33±0.07)％、(0.63±0.19)％、(0.55±0.15)％。PBSCT組在+60天明顯高于BMT組(P=0.04

32、62)。MSD-BMT中，發(fā)生aGVHD和未發(fā)生aGVHD患者輸注NKT細(xì)胞數(shù)量和外周NKT細(xì)胞數(shù)量分別為(0.33±0.06)×106/kg、(0.40±0.10)×106/kg(P>0.05)和(0.9±0.18)×106/L、(1.1±0.25)×106/L(P>0.05)。MUD-PBSCT中，發(fā)生aGVHD和未發(fā)生aGVHD患者輸注NKT細(xì)胞數(shù)量和外周NKT細(xì)胞數(shù)量分別為(0.29±0.07)×106/kg、(0.26±0.0