涼膈散對(duì)內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及其炎癥調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種常見危重病，病死率極高，嚴(yán)重威脅重癥患者的生命并影響其生存質(zhì)量。ARDS早期的特征性表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞屏障的通透性增高，肺泡與肺間質(zhì)內(nèi)積聚大量的水腫液，其中富含蛋白及中性粒細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞。目前對(duì)于ALI尚缺乏理想的防治手段，成為危重病醫(yī)學(xué)的

2、難點(diǎn)之一。中西醫(yī)結(jié)合是我國(guó)防治ALI的特色和優(yōu)勢(shì)，一些學(xué)者從臨床入手，將中醫(yī)學(xué)理論和方法用于全身炎癥反應(yīng)綜合征（System inflammatory response syndrome，SIRS）、ALI、ARDS治療取得較好成績(jī)，相關(guān)基礎(chǔ)研究也出現(xiàn)良好前景。隨著中醫(yī)溫?zé)岵〔∫虿C(jī)理論與現(xiàn)代病理生理學(xué)相關(guān)理論的交流和滲透，人們?cè)趯?duì)ALI發(fā)生發(fā)展規(guī)律的認(rèn)識(shí)與防治研究方面產(chǎn)生了有益的借鑒，如對(duì)中醫(yī)溫?zé)岵〗舛痉▽?shí)質(zhì)及解毒方藥作用機(jī)理的深入研

3、究為我們防治ALI提出新的策略與方法。 炎癥本質(zhì)上是機(jī)體的防御反應(yīng)，但炎癥失控又可損傷自身細(xì)胞，炎癥是否失控取決于炎癥和抗炎反應(yīng)之間能否達(dá)到相對(duì)平衡。ALI作為機(jī)體過度炎癥反應(yīng)的后果，調(diào)控炎癥反應(yīng)則是防止ALI發(fā)生發(fā)展、降低死亡率的關(guān)鍵所在。目前已有一些藥物在臨床試用，如糖皮質(zhì)激素、環(huán)氧化酶抑制劑、血栓烷合成酶抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、抗內(nèi)毒素及細(xì)胞因子單克隆抗體或拮抗劑等。但是這些藥物在大樣本臨床試驗(yàn)中并未獲得肯定療效，仍然缺乏

4、一種特異而有效的治療手段。 急性肺損傷的發(fā)病，目前多認(rèn)為巨噬細(xì)胞被激活后募集多型核白細(xì)胞（PMN）至肺引起炎癥反應(yīng)占主導(dǎo)地位。革蘭（氏）陰性桿菌（Gram negative bacilli，GNB）感染后，LPS引發(fā)機(jī)體SIRS和代償性抗炎反應(yīng)綜合征（CARS），過度的SIRS則發(fā)展為多臟器功能障礙綜合征（MODS），在肺的表現(xiàn)為ALI。ALI時(shí)幾乎肺內(nèi)所有種類的細(xì)胞都涉及了這個(gè)炎癥反應(yīng)，并釋放大量的炎性介質(zhì)，而肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、

5、肺上皮細(xì)胞既是效應(yīng)細(xì)胞又是致病因子作用的靶細(xì)胞。參與的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)有促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6、血小板活化因子（PAF）和磷脂酶A2（PLA2）等?？寡准?xì)胞因子有IL-4、IL-10、IL-13、IL-1ra等，兩者之間的平衡維持機(jī)體環(huán)境的穩(wěn)定，若兩者失衡，即發(fā)生失控性SIRS或過度代償性炎癥反應(yīng)綜合征，均可導(dǎo)致組織或器官功能損害。 中藥具有多靶點(diǎn)作用，對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的治

6、療有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在中醫(yī)溫?zé)岵±碚撝?，“毒”是決定疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的重要因素和病理核心。其既可由外直接侵入，亦可由“六淫”所化。因“毒”所致病證常有發(fā)病急、病情重、傳變快等特點(diǎn)。中醫(yī)解毒是中醫(yī)治療溫?zé)岵√貏e是熱毒證的最為常用治療方法，在長(zhǎng)期醫(yī)療實(shí)踐中得到了豐富和發(fā)展，產(chǎn)生了清熱解毒、涼血解毒、清營(yíng)化毒、通腑泄毒、益氣解毒等具體治法，其應(yīng)用范圍也日益擴(kuò)大，我們認(rèn)為對(duì)包括ALI在內(nèi)的諸多熱毒證候，早用解毒方法，常能防傳杜變、化險(xiǎn)為夷，即所

7、謂“解毒不厭早”。中藥解毒作用及作用機(jī)理現(xiàn)代研究，主要體現(xiàn)在抗病原微生物、抗毒素作用，免疫調(diào)節(jié)作用，解熱、抗炎作用以及改善微循環(huán)、抗自由基損傷等方面。 涼膈散（載宋《和劑局方》）為溫病治療常用名方，具有清上瀉下、解毒排毒之功效。本課題組在以往的研究中，從調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生過程中效應(yīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度探討解毒作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)涼膈散能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞CD14、p38促分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF

8、-κB）表達(dá)的增強(qiáng)，同時(shí)還能抑制小鼠體內(nèi)炎癥因子TNF-α及IL-6的表達(dá)，減輕肝、肺組織損傷?；谝陨系恼J(rèn)識(shí)，我們提出：以溫?zé)岵±碚摓橹笇?dǎo)，運(yùn)用中醫(yī)解毒法干預(yù)ALI病理過程可能是有效的治療方法，涼膈散可能是抗內(nèi)毒素性ALI的有效方劑；涼膈散可能是通過多種有效成分、多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、多個(gè)作用靶點(diǎn)調(diào)控炎癥反應(yīng)，以維護(hù)機(jī)體炎癥、抗炎反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡的，而這種綜合性治療作用對(duì)于ALI是有益的防治策略。 方法：1.受試藥物是涼膈散。

9、 2.分組及模型制作; 156只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（ig生理鹽水，iv生理鹽水）；LPS組（ig生理鹽水，iv LPS5mg/kg）；LPS+涼膈散（ig7.5g生藥/kg，iv LPS5mg/kg）；LPS+涼膈散（ig15g生藥/kg，iv LPS5mg/kg）； LPS+涼膈散（ig，30g生藥/kg，iv LPS5mg/kg）；LPS+地塞米松（ig DEX0.135mg/kg，iv LPS5mg/kg）

10、。LPS造模動(dòng)物，又分為注射LPS后1、2、4、8、16h不同時(shí)相處死組，每組6只。灌胃給藥，每天一次，共5d，末次給藥后次日各組大鼠尾靜脈注射內(nèi)毒素脂多糖LPS5mg/kg，建立大鼠急性肺損傷模型，然后在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取血和肺組織。 3.檢測(cè)指標(biāo); 3.1,動(dòng)脈血PaO2; 3.2,肺水含量及肺系數(shù)測(cè)定; 3.3,肺通透性指數(shù)測(cè)定; 3.4,肺損傷組織病理形態(tài)學(xué); 3.5, TN

11、F-α、IL-1β、IL-10含量檢測(cè); 3.6, Th1/Th2細(xì)胞因子的檢測(cè); 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，動(dòng)脈血PaO2、濕干重比值及肺系數(shù)、肺通透性指數(shù)、細(xì)胞因子含量檢測(cè)結(jié)果比較運(yùn)用單因素方差分析（One-way ANOVA）和均數(shù)間多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.動(dòng)脈血PaO2（mmHg）的變化; 所有實(shí)驗(yàn)

12、大鼠的吸氧濃度均為21%，故以動(dòng)脈血氧分壓PaO2代替氧合指數(shù)進(jìn)行比較，LPS可以誘導(dǎo)大鼠PaO2顯著降低，其中4、8、16h點(diǎn)PaO2在LPS組較對(duì)照組顯著降低（P<0.01），涼膈散組、地塞米松組較LPS組顯著增加（P<0.05）。 2.肺水含量（W/D）的變化; LPS可以誘導(dǎo)大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量值W/D升高，其中4、8、16h點(diǎn)W/D在LPS組較對(duì)照組顯著增加（P<0.01），涼膈散組、地塞米松組較LPS組

13、顯著降低（P<0.05，P<0.01）。 3.肺系數(shù)（LI）變化; LPS可以誘導(dǎo)大鼠肺重/體重比值升高，其中4、8、16h點(diǎn)LI在LPS組較對(duì)照組顯著增加（P<0.01），涼膈散組、地塞米松組較LPS組顯著降低（P<0.05，P<0.01）。 4.肺通透性指數(shù)（LPI）的變化; LPS可以誘導(dǎo)大鼠肺BLAF蛋白/血漿蛋白比值升高，其中4、8、16h點(diǎn)LPI在LPS組較對(duì)照組顯著增加（P<0.01），

14、涼膈散高、中劑量組、地塞米松組較LPS組顯著降低（P<0.05）。 5.肺組織病理改變; 光鏡觀察：空白對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，壁光滑，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出液。各LPS組尾靜脈注射LPS5mg/kg后4h，LPS組大體觀察肺，可見肺體積增大，表面有斑點(diǎn)狀出血灶。至8h及16h，肺水腫程度明顯，肺表面出血點(diǎn)增多，光鏡觀察見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并擴(kuò)散到肺泡腔內(nèi)，肺泡隔增厚，肺間質(zhì)及肺泡水腫、間質(zhì)及肺泡內(nèi)出血。肺泡膨脹不全或肺泡

15、融合。涼膈散各組鏡下顯示病變程度較LPS組輕，滲出比模型組明顯減少，DEX組損傷傷程度介于LPS組與對(duì)照組之間。 6.大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10含量檢測(cè); LPS組大鼠TNF-α含量在LPS致傷后1h開始升高，至2h達(dá)到最高峰，隨后迅速下降；IL-1β含量在LPS致傷后2h顯著升高，至8h達(dá)到峰值，隨后迅速下降；IL-10含量在LPS致傷后2h開始升高。涼膈散各劑量組及地塞米松組與LPS組比較，TNF-α、

16、IL-1β、大鼠肺濕/干重比值顯著下降，IL-10明顯上升（P<0.05，P<0.01）。 7.大鼠細(xì)胞內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞因子含量檢測(cè); LPS致傷后，LPS組大鼠外周血與BALF中Th1的含量在4、8、16h時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較明顯下降，外周血與BALF中Th2的含量在4、8、16h時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較明顯升高（P<0.05，P<0.01），提示大鼠尾靜脈注射LPS后，Th1向Th2漂移。涼膈散中、高劑量組與地塞米松組

17、的Th1/Th2比例趨于接近正常（P<0.05，P<0.01）。 結(jié)論：1.涼膈散能顯著降低內(nèi)毒素引起的肺組織濕/干重比值，減少肺水含量，降低肺通透性指數(shù)；PaO2較模型組明顯提高；病理結(jié)果也顯示，其能減少炎癥細(xì)胞的肺內(nèi)積聚，減少肺泡萎陷及肺實(shí)變的發(fā)生。 2.涼膈散可顯著降低內(nèi)毒素引起的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的釋放，以及升高抗炎介質(zhì)IL-10的表達(dá)。 3.涼膈散能夠使Th1/Th2比例趨于接近正常。