Imipramine對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的抗炎癥、抗凋亡作用的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的臨床發(fā)病率和病死率均較高,目前臨床各種治療手段尚未能使其病死率明顯下降。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠炎癥性肺損傷為研究對(duì)象,探討通過imipramine抑制應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)酰胺生成的關(guān)鍵酶酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)是否對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是急性肺損傷

2、發(fā)生、發(fā)展的重要病理過程,本課題就imipramine對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中肺組織炎癥反應(yīng)和肺組織細(xì)胞凋亡的兩方面的影響進(jìn)行研究并探討相關(guān)分子機(jī)制,為通過調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺的生成治療急性肺損傷提供一定的理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　采用LPS腹腔注射的方法誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的動(dòng)物模型,并在LPS誘導(dǎo)前30min給予imipramine干預(yù),按照處理方式的不同分為四組:Sham+imipramine,Sham+vehicl

3、e,LPS+imipramine和LPS+vehicle。記錄生存時(shí)間,計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組的生存率;觀察不同時(shí)間點(diǎn)不同實(shí)驗(yàn)組中急性肺損傷各指標(biāo)(肺組織病理學(xué)變化、W/D(Wet/Dry,濕干重比)、MPO(myeloperoxidase,髓過氧化物酶)、肺組織炎癥因子mRNA表達(dá)、支氣管肺泡灌洗液和血清中炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的指標(biāo)(Bcl-2和Bax蛋白含量)的變化;通過對(duì)NF-κB(nuclear factor kappa B,核因子k

4、appa B)活性和含量、p38、JNK和Txnip(thioredoxin-interacting protein,硫氧還蛋白反應(yīng)蛋白)蛋白表達(dá)的檢測(cè),進(jìn)一步探討imipramine抑制小鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)和凋亡的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.腹腔注射LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥性肺損傷,其模型容易復(fù)制,肺損傷程度較穩(wěn)定、均勻,肺組織病理變化也證實(shí)符合小鼠急性肺損傷的病理改變。
　　2.在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷前30m

5、in給予小鼠imipramine干預(yù)可以顯著改善急性肺損傷小鼠的生存率(P＜0.05)。
　　3.肺組織病理學(xué)改變及評(píng)分:imipramine的應(yīng)用改善了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織的病理?yè)p傷,并且通過肺組織損傷病理評(píng)分,我們發(fā)現(xiàn)imipramine干預(yù)在12h(9.65±0.43VS11.9±0.80,P＜0.05)、18h(11.05±0.73VS14.30±0.39,P＜0.05)顯著降低了急性肺損傷小鼠肺組織病理?yè)p傷評(píng)分。這表明

6、imipramine可以減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理?yè)p傷。
　　4.肺組織W/D:LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后,肺組織W/D增加,12h達(dá)到高峰5.24±0.11。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織W/D在6h(4.80±0.04VS5.16±0.05,P＜0.05)、12h(4.87±0.11VS5.24±0.11,P＜0.05)和18h(4.77±0.07VS5.14±0.03,P＜0.05)均顯

7、著降低。
　　5.肺組織MPO活性:LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后,肺組織MPO活性增加,18h達(dá)到高峰37.55±5.67Units/min/mgprotein。與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織MPO活性在12h(10.10±1.28Units/min/mgproteinVS28.48±7.53Units/min/mgprotein,P＜0.05)和18h(11.39±1.36Units/min/

8、mgproteinVS37.55±5.67Units/min/mgprotein,P＜0.05)均顯著降低。
　　6.支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子濃度:TNF-α和IL-10在6h的基礎(chǔ)水平分別是218.50±22.11pg/ml,和83.02±15.33pg/ml。LPS刺激后TNF-α和IL-10水平均明顯升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平達(dá)到最高峰,分別為3860.31±274.80pg/ml和2809.00±

9、143.70pg/ml。Imipramine干預(yù)在6h和12h顯著降低了TNF-α(6h:2204.00±242.30VS3860.31±274.80,12h:2236.00±348.0VS3612.00±412.70,P＜0.05)和IL-10(6h:1645.00±222.50VS2809.00±143.70,12h:1463.00±137.80VS2117.00±117.20,P＜0.05)水平。
　　7.血清中炎癥因子濃度

10、:LPS刺激后血清中TNF-α和IL-10的變化趨勢(shì)與其在支氣管肺泡灌洗液中變化趨勢(shì)相似。TNF-α和IL-10在6h的基礎(chǔ)水平分別是228.90±54.72pg/ml,236.55±45.92pg/ml。LPS刺激后TNF-α和IL-10水平均明顯升高。在LPS刺激6h后TNF-α和IL-10水平達(dá)到最高峰,分別為3619.76±376.30pg/ml和3261.16±484.70pg/ml。Imipramine干預(yù)也在6h和12h顯

11、著降低了TNF-α(6h:1871.00±435.70VS3619.76±376.30,12h:1250.00±329.40VS2832.00±201.10,P＜0.05)和IL-10(6h:1755.00±281.50VS3261.16±484.70,12h:1283.00±153.80VS2221.00±330.00,P＜0.05)水平。
　　8.肺組織炎癥因子mRNA表達(dá):LPS刺激后肺組織中炎癥因子mRNA表達(dá)均顯著增加。

12、與LPS+Vehicle組相比,LPS+imipramine組肺組織中TNF-αmRNA表達(dá)水平在6h和12h顯著降低,IL-6mRNA表達(dá)水平在18h顯著降低,IL-10mRNA表達(dá)水平在6h顯著降低。
　　9.NF-κBp65活性和含量:LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中小鼠肺組織NF-κBp65活性和含量均顯著增加,而imipramine干預(yù)可以在6h和12h顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κBp65活性的增加,并在12h顯著抑制L

13、PS誘導(dǎo)的NF-κBp65含量的增加。
　　10.肺組織凋亡指標(biāo):imipramine干預(yù)可使Bcl-2蛋白表達(dá)量增加,Bax蛋白表達(dá)量減少,即imipramine干預(yù)可以減輕肺組織凋亡。
　　11.imipramine干預(yù)可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的pp38、pASK1和Txnip蛋白表達(dá)的增加。
　　結(jié)論:
　　1.在LPS誘導(dǎo)急性肺損傷前30min給予小鼠imipramine干預(yù)可以顯著改善急性肺損傷小鼠的生存