腎胺酶對(duì)SD大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　研究在心肌腎胺酶缺乏、腎胺酶正常表達(dá)及腎胺酶重組蛋白預(yù)處理三種條件下，SD大鼠心肌缺血再灌注（I/R）損傷、細(xì)胞凋亡程度及組織腎胺酶表達(dá)變化，初步探索腎胺酶在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):慢病毒載體介導(dǎo)的腎胺酶基因沉默干擾序列（LV-Rnls-RNAi）轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，運(yùn)用QPCR及Western-Blot方法鑒定腎胺酶基因表達(dá)抑制效率，篩選出對(duì)腎胺酶基因有高

2、效抑制的靶序列。
　　2.SD大鼠心肌細(xì)胞腎胺酶基因沉默模型建立:15只SPF級(jí)雄性10周齡SD大鼠(280-320g)，平均隨機(jī)分為5組（分別為0d組、4d組、7d組、10d組、14d組）;除基線組（0d組）外，每只大鼠心包腔注射100ul方法1中篩選出的滴度為1E+8TU/ml的慢病毒，分別在第0天（0d組）、4天（4d組）、7天（7d組）、10天（10d組）、14天（14d組）處死對(duì)應(yīng)各組大鼠，QPCR及Western-Bl

3、ot方法鑒定心肌腎胺酶表達(dá)，選取最佳感染時(shí)間。
　　3.心肌缺血再灌注（I/R）損傷模型:36只SPF級(jí)雄性10w齡SD大鼠(280-320g)，平均隨機(jī)分為6組，分別為腎胺酶基因干擾組（RNAi組）、腎胺酶基因干擾陰性病毒對(duì)照組（RNAi-NC組）、正常手術(shù)組(Normal組)、假手術(shù)組（Sham組）、腎胺酶重組蛋白預(yù)處理組（Protein組）、蛋白溶媒(PBS)預(yù)處理組(Vehicle)。I/R模型建立方法為結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降

4、支45min，再灌注24h;其中RNAi組及RNAi-NC組在I/R術(shù)前10天按方法2中建立腎胺酶基因沉默模型;Protein組及Vehicle組分別術(shù)前10min皮下注射腎胺酶重組蛋白(1.5mg/kg)及同體積PBS; Sham組穿線不結(jié)扎。采用Elisa檢測(cè)術(shù)前、術(shù)后血漿腎胺酶及去甲腎上腺素(NE)變化;雙染色法測(cè)定心肌壞死及梗死面積;TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;QPCR及Western-Blot方法檢測(cè)心肌組織腎胺酶表達(dá)。

5、>　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后LV-Rnls-RNAi(19810-1)、LV-Rnls-RNAi(19811-1)、LV-Rnls-RNAi(19813-1)三組較對(duì)照組，腎胺酶基因表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各自抑制效率分別為63.47％、32.69％、93.66％，進(jìn)一步檢測(cè)LV-Rnls-RNAi(19813-1)轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)抑制效率為83.1％。
　　2.心包注射慢病毒前后，大鼠血壓、體重等

6、各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，轉(zhuǎn)染術(shù)后第10d、14d明顯腎胺酶基因表達(dá)較0d明顯降低(P＜0.05)，第10d與14d之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，進(jìn)一步檢測(cè)第10d組大鼠心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)抑制效率為63.89％。
　　3.(1)各組大鼠I/R術(shù)前及術(shù)后，血壓、體重各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。I/R術(shù)后雙染色法顯示各組缺血區(qū)面積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各組壞死面積比較RNAi-NC組、正常手術(shù)組

7、及Vehicle組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05(n=3)，RNAi組及蛋白預(yù)處理組分別與各自對(duì)照組相比有顯著性差異，P＜0.05(n=3);RNAi組較正常手術(shù)組細(xì)胞凋亡明顯增加，P＜0.05(n=3);蛋白預(yù)處理組較正常手術(shù)組，細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，P＜0.001(n=3)。(2)心肌組織腎胺酶基因表達(dá)在手術(shù)組均降低，較假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); RNAi組較RNAi-NC組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

8、0.05)。心肌組織腎胺酶蛋白表達(dá)結(jié)果與基因表達(dá)一致。(3)術(shù)前血漿腎胺酶、NE各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后血漿腎胺酶僅Protein組較Vehicle有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043);術(shù)后NE水平在RNAi組、RNAi-NC組及Vehicle組有下降，較各組術(shù)前差異顯著(P＜0.05)，同時(shí)較術(shù)后Sham組有明顯差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Rnls-RNAi(19813-1)轉(zhuǎn)染后