水稻白葉枯病抗性基因Xa14的定位與候選基因的篩選.pdf

1、由水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，簡稱Xoo）引起的水稻白葉枯病是是一種嚴(yán)重的水稻細(xì)菌性病害，目前已經(jīng)鑒定出約30個白葉枯病抗性基因，其中Xa1、xa5、Xa21、Xa26、Xa27被分離和克隆出來。Xa14是高抗Xoo菲律賓生理小種5（P5）的顯性基因，1987年Taura等將其定位在水稻第4染色體長臂末端，1998年譚震波等將其定位于標(biāo)記RG620和G282之間，2004年本室鮑思元等將其

2、定位在HZR970-8和HZR988-1之間。本研究的目的是對Xa14進一步精細(xì)定位，并對鮑思元等定位的區(qū)域內(nèi)與抗性相關(guān)基因進行遺傳和功能分析，主要結(jié)果如下： 1．構(gòu)建包含3300個單株的IRBB14／IR24的F2群體，用14對在兩親本間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記將Xa14定位在HZR970-8和HZR669-2之間，并與標(biāo)記HZR645-4共分離。完全覆蓋nipponbare的BAC克隆OSJNBb0085C12和BAC克隆OS

3、JNBa0053K19，部分覆蓋BAC克隆OSJNBa0058K23和BAC OSJNBB0060E08，約324 kb的距離。 2．用FGENESH和GENESCAN對標(biāo)記HZR970-8和HZR988-1之間的DNA序列進行分析，與F.QI等的預(yù)測結(jié)果進行比較，篩選含有與抗性有關(guān)保守結(jié)構(gòu)（如NBS, LRR, Kinase等）的基因。經(jīng)過篩選，共得到6個含有NBS結(jié)構(gòu)的候選基因，成簇分布在BAC克隆OSJNBb0085C11

4、2上，按排列順序分別命名為RGA1、RGA5、RGA6、RGA7、RGA12和RGA14。 3．提取抗病親本IRBB14和感病親本IR24接種病菌后的總RNA，反轉(zhuǎn)錄。對這6個抗性相關(guān)基因分別設(shè)計特異引物，PCR驗證，發(fā)現(xiàn)RGA1和RGA5在兩個親本中表達(dá)，但RGA12僅在IRBB14中表達(dá)。在未接種條件下，剪取材料IR24、IRBB14、MDJ和TP309正常生長時的健康葉片，分別提取RNA，RT-PCR驗證RGA1和RGA5

5、在IR24、IRBB14、MDJ和TP309都為組成型表達(dá)；RGA12在IRBB14、MDJ和TP309為組成型表達(dá)，在IR24中不表達(dá)。將這3個基因確定為Xa14的候選基因。 4．對這3個侯選基因設(shè)計引物，進行長片段擴增，得到三個候選基因的全長序列，經(jīng)TA克隆，大腸桿菌增殖后，經(jīng)質(zhì)粒操作連接到表達(dá)載體pCAMBIA1301S中，電擊入農(nóng)桿菌。經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，將候選基因轉(zhuǎn)入感病材料臺北309和珍珠矮中，再生，獲得再生植株，實驗室考